“靶位定向攻击”治疗肌无力症的新思路.docVIP

“靶位定向攻击”治疗肌无力症的新思路 【摘要】：乙酰胆碱受体(Acetylcholinereceptor,AChR)是一种配体介导的离子通道蛋白,由2α,β,γ(ε)δ共5个亚基组成。其中成熟的α亚基是自身免疫病重症肌无力(MyastheniaGravis,MG)的主要免疫原,重症肌无力患者由于自身免疫系统的紊乱,体内产生了非正常的乙酰胆碱受体抗体,该抗体可与乙酰胆碱受体的α67-76,α125-147,α183-200氨基酸残基结合,减少功能性乙酰胆碱受体数量,抑制乙酰胆碱受体与乙酰胆碱结合,阻碍骨骼肌间神经传导。因此,长期以来,科学家们一直以AChRα-亚基N-端主要功能区片段为研究对象,从不同角度探讨MG的发病机理及其治疗的可能手段。本论文在前期工作的基础,着重进行了以下几个方面的研究。AChR_(α205)读框被克隆到含不同启动子的表达载体中(如pUC118,pET32M,pMAL-c2等)中,并在E.coliBL21中进行表达,其中目的蛋白只有在重组菌E.coliBL21/pMAL-AChR_(α205)中获得了可溶性表达产物MBP-AChR_(α205),表达量可达到细胞总蛋白的30%,这也是国内外第一次获得AChRα亚基主要功能区的可溶性表达。经Amylose亲和纯化获得了融合蛋白MBP-AChR_(α205),而且经FactorXa拆除可获得单一的AChR_(α205)。同时,偶联在Amylose的MBP-AChR_(α205)可作为一种免疫吸附剂。对小鼠抗AChR血清的免疫吸附实验表明,大约75%-98%的AChRAb可以被特异性清除,而血清蛋白、IgG、IgM、IgA仍能维持在正常水平。2例MG病人血清经该免疫吸附剂吸附后,AChRAb的清除率可达90%以上,清除效率要比那些化学合成的免疫吸附剂高的多。ELISA验证在免疫吸附过程中,没有MBP-AChR_(α205)或AChR_(α205)的脱落。同时,我们也将目的基因片段延伸到AChR_(α211),并克隆到酵母表达载体pVT、pGAPZαA、pPIC9K中,转入酿酒酵母和毕赤酵母中进行分泌型表达。实验结果表明,重组菌P.pastorisGS115/pPIC9K-AChR_(α211)可以分泌表达有功能活性的目的蛋白,表达量可达到25mg/L。经阴离子交换层析和凝胶过滤层析,可获得电泳纯目的蛋白,并制备成免疫吸附剂,对两例肌无力患者血清中的AChRAb清除率可分别达到84%和94%。【关键词】：乙酰胆碱受体α亚基重症肌无力重组免疫吸附剂内蛋白子介导的蛋白质连接基因免疫 【学位授予单位】：山西大学 【学位级别】：博士 【学位授予年份】：2005 【分类号】：R746.1 【目录】：第一章乙酰胆碱受体与重症肌无力(综述)15-321前言152乙酰胆碱受体结构与功能15-202.1乙酰胆碱受体的结构15-172.2乙酰胆碱受体的作用机理172.3乙酰胆碱受体结构与功能的关系17-203重症肌无力发病机理及治疗方法20-243.1重症肌无力形成机理20-223.2重症肌无力的细胞免疫机理223.3重症肌无力的治疗方法22-244重症肌无力治疗的新战略—免疫毒素24-294.1核糖体失活蛋白24-274.2免疫毒素27-295参考文献29-32第二章乙酰胆碱受体主要功能区的延伸与分子亚克隆32-401前言322材料32-342.1主要仪器设备32-332.2主要试剂332.3主要试剂配制33-342.4菌种和质粒343方法34-363.1寡核甘酸片段的双链形成34-353.2重组质粒pUC-AChR_(α205)的分子克隆353.3重组质粒的鉴定353.4工程菌的诱导与表达35-364结果36-384.1DNA片段双链的合成364.2重组质粒pUC-AChR_(α205)的鉴定36-374.3目的基因的序列分析374.4重组质粒在E.coliDH5α中的初步表达37-385讨论38-396参考文献39-40第三章乙酰胆碱受体α亚基主要功能区在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及免疫活性40-611前言402材料40-422.1主要仪器设备402.2主要试剂及配制40-422.3菌种与质粒423方法42-483.1AChR_(α205)基因片段的克隆及重组子的构建42-443.2目的蛋白在不同重组菌的表达44-453.3MBP-AChR_(α205)融合蛋白的表达和纯化45-473.4MBP-AChR_(α205)和AChR_(α205)蛋白的免疫学性质47-483.5免疫吸附剂的制备及其吸附性能484结果48-594.1重组子的双酶切鉴定48-504.2AChR_(α205)在不同表达载体中的表达50-514.3融合蛋白MBP-AChR_(α205)的纯化51-534.