《生物化学》实验四小牛肝脏DNA的制备.docVIP

《生物化学》实验四 小牛DNA的制备是的主要成分，同时也是组成的DNA是一种分子，可组成遗传指令，以引导生物发育与生命机能运作主要功能是长期性的资讯储存带有遗传讯息的DNA片段称为基因，其他的DNA序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传讯息的表现。DNA是大分子高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度。DNA对紫外线有吸收作用，当核酸变性时，吸光值升高；当变性核酸可复性时，吸光值又会恢复到原来水平。温度、有机溶剂、酸碱度、、等试剂都可以引起DNA分子变性，即使得DNA双键间的断裂，双螺旋结构解开。1.1 材料采集及使用试剂 1.11材料：新鲜冷冻的小牛肝脏 1.12试剂：95%?乙醇和无水乙醇氯仿－异戊醇混合液??0.1mol/L氯化钠10%氯化钠溶液滴入ml 20% SDS，将取出的水相滴入予冷的95%乙醇中，边滴加边用玻璃棒搅拌起白色纤维状DNA沉淀。搅拌速度对产率有影响，若产出减少可补加或换新乙醇。搅起的DNA置于已称重的小培养皿内，依次用95%乙醇和无水乙醇清洗纤维状DNA沉淀至无浑浊为止准确称取50～100mg?DNA，加少量0.1mol/L?NaOH溶解，加定容至50ml紫外分光光度计测定制备的DNA的紫外吸收曲线，测定A260和A280，并计算比值：A260/A280，纯DNA的此比值约为1.8。⑶?根据：每毫升1微克的纯DNA的A260值=?0.020，计算所得DNA的纯度DNA的存在状态，增加了感性认识，其次，掌握了DNA的制备方法以及细胞分级，细胞核制备，细胞膜裂解和解离DNA-蛋白复合体（DNP）的技术。并且学习了用紫外分光光度计测定DNA含量的方法。 参考文献： [1]王镜岩 朱圣庚 徐长法主编。生物化学教程。 [2]王林嵩主编。生物化学实验教程。 附：实验原理 核酸是重要的生物大分子。在细胞核内，核酸通常是与某些组织蛋白质结合成复合物，即以脱氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在。因此，在提取和制备DNA时，首先必须设法将这两类核蛋白分开。在不同浓度的盐溶液中，RNP与DNP的溶解度有很大的差别。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随着NaCl浓度的增加而逐渐下降，当NaCl?浓度为0.14mol/L时，DNP的溶解度仅为其在纯水中溶解度的1%，而当NaCl浓度继续增加时，DNP的溶解度又渐次增大，当NaCl浓度增至0.5?mol/L时，DNP的溶解度约与其在纯水中的溶解度近似，当NaCl浓度继续增加至1.0?mol/L时，DNP的溶解度约为其在纯水中的溶解度的两倍，且随着盐浓度的上升，其溶解度仍继续呈增大的趋势。但RNP则与之不同，在0.14?mol/L的盐溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相当大，因此，通常采用0.14?mol/L的盐溶液来除去RNP，使DNP仍保持在沉淀中，然后使用浓盐溶液（1.7?mol/L浓度以上的NaCl）来提取DNP提取出DNA-蛋白质复合体（DNP）后，还必须将其中的蛋白质除去，因此，提取纯化DNA要经过1.制备细胞核2.?裂解细胞核3.?解离DNA—蛋白质复合体；4.?从可溶性物质中分离出DNA。本实验通过匀浆、离心得到细胞核组分，然后用SDS（十二烷基硫酸钠，sodium?dodecyl?sulfate）裂解核膜，释放出DNA-蛋白质复合物，再加入高浓度NaCl，以增加DNP的溶解度，然后加入氯仿—异戊醇混合液，振荡、乳化，使蛋白质变性，DNP复合物解离，离心后，DNA溶于上层水相，蛋白质沉淀夹在水相和有机相之间得以除去，最后用有机溶剂沉淀出DNA。