人参总DNA导入马铃薯及其变异后代检测的研究.pdfVIP

人参总DNA导入马铃薯及其变异后代检测的研究 洪亚辉心3，刘静雅3，熊兴耀u4 (1．湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室，长沙410128； 2．湖南省马铃薯工程技术研究中心，长沙410128； 3．湖南农业大学生物科学技术学院，长沙410128； 4．湖南农业大学园艺园林学院，长沙410128) 摘 要：CrAB法提取人参总DNA，经检测、纯化后获得符合导入条件的DNA(0D2印，230 nm=1．8，OD260／280nm=2．0)；马铃薯愈伤组织打碎过滤的小细胞团作为受体。浸泡共培法导 入人参总DNA，得到转化体植株。选用随机引物分别对转化体、对照体、供体进行RAPD检 测，扩增结果发现转化体含有对照体和供体的条带，表明供体某些DNA片段在受体基因组中得 到有效的整合。并从细胞水平以及生化水平的检测，均发现转化后代与对照有明显的差异。 关键词：马铃薯；总DNA导入；RAPD 自从20世纪70年代周光宇教授提出DNA片段杂交假设以来，应用“花粉管通道法”、 “浸泡法”等方法将外源DNA导人植物已成为一种新的有效的遗传转化方法。总DNA直接 导人法逾越了常规育种中的生殖障碍，弥补了细胞工程技术繁琐、植株再生频率低、后代 群体小，难以筛选等缺陷。总DNA直接导人技术，被公认是实现远缘杂交的有效途径， 并在多种作物中得到了能稳定遗传的优良品系【I--31。“浸苗法”已在烟草、大豆、蚕豆等作物 中得到了实际应用，并实现了遗传转化141，朱生伟等人应用浸苗法成功地将外源DNA导人 烟草，导入后代在形态、品质和成分等方面已产生广泛的变异嘲。 人参一向被称为中药之王名闻世界，近代中医常用人参补气救脱、益气复脉、养心安 神、生津止渴、补肺定喘等[61。现代医学研究证明人参除含有功能成分人参皂甙外，还含 有糖类、多种氨基酸、蛋白质、维生素及微量元素等营养物质。 本研究以马铃薯为转化受体，以人参为转化供体，用RAPD作为分析手段，并结合细 胞水平与生化水平的分析检测，试图通过转基因技术将人参总DNA导人马铃薯，培育出 具有药用价值、保健作用或较高营养的马铃薯新新品种。 l 材料与方法 1．1材料 受体材料：马铃薯栽培品种(大西洋)，由湖南省马铃薯工程技术研究中心提供。 供体材料：新鲜人参(产自吉林省抚松县)。 基金项目：薯类燃料乙醇和生物柴油转化关键技术研究与示范(2006BADolA06．1—8) 作者简介：洪亚辉(1956-)，女，教授．从事马铃薯遗传育种研究。 ·-——219—-一 1．2 DNA攫取和导入 与紫外分光光度计法检测DNA分子的浓度和纯度。 采用受体细胞与供体总DNA共培养渗透导人方法：选取健壮无病虫害的马铃薯大西 1．0 1．5 洋12号的茎段，接种于MS+NAA rag·L“+2．4-Dmg·L-1的固体培养基中，取生长 对数期的愈伤组织作为导人的受体，将愈伤组织打碎过滤于100目钢筛，置于DNA溶液 1．0 15 (浓度为300¨g‘mL-1)与加入凝聚剂SILWET的液体培养基(MS+NAA mg·L。。+20一D mg·L_1)中，并设置对照．共培养Io一15 d左右转到分化培养基上诱导成苗。 1．3 RAPD扩增 分别以人参供体和转化体以及对照体材料DNA为模版，以s系列随机引物(上海生物 工程合成)进行PCR扩增，反应体系为20止，94℃预变性4min；94℃1min．36℃1 acl_5 mln，72 rain，共40个循环；72℃终延伸10rain；4℃保存。l0％的琼脂糖凝胶电 泳．Syngene凝胶成像分析系统观察记录。