利用PyrobestDNA聚合酶一步法进行大片段基因的定点突变.pdfVIP

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2017-08-22 发布于重庆
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利用PyrobestDNA聚合酶一步法进行大片段基因的定点突变.pdf

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利用PyrobestDNA聚合酶一步法进行大片段基因的定点突变.pdf

生物技术通讯 590 LETTERSINBIOTECHNOLOGY Vol.18No.4Jul.,2007 文章编号：1009-0002(2007)04-0590-04 研究报告利用PyrobestDNA聚合酶一步法进行大片段基因的定点突变 1a,1b 1a,1b,2 2 2 2 2 2 2 朱大兴 ,周清华 ,王艳萍 ,车国卫 ,唐小军 ,朱文 ,陈小禾 ,孙芝琳天津医科大学总医院肺部肿瘤外科, 天津市肺癌研究所,天津 ; 1. a. b. 300052 2.四川大学华西医院四川省肺癌分子生物学重点实验室,四川成都 610041 [摘要] 目的:介绍一种简单、快速、高效和经济的进行大片段基因定点突变的方法。方法:小量抽提含有NM23H1-EGFP 融合基因的逆转录病毒真核表达质粒pLXSN-NM23H1-EGFP,体外合成突变引物对,利用高保真PyrobestDNA聚合酶对质粒DNA进行PCR突变反应,然后用DpnⅠ限制性内切酶消化PCR产物以去除模板DNA,取适量消化产物转化大肠杆菌 ,随机挑选克隆进行测序筛选、鉴定所需突变株。结果:在基因中引入了、、、 XL1-Blue NM23H1-EGFP S44AP96SH118F 、等个替换突变位点及处的插入突变。结论:该方法简单、快速、高效、经济,不须纯化中间产物, S120GP96S-S120G 5 9bp 不须亚克隆,突变效率几乎为 100%,是一种值得推广应用的方法。 [关键词] 聚合酶;定点突变; PyrobestDNA PCR [中图分类号] Q78 [文献标识码] A One-StepandCost-EffectiveSite-DirectedMutagenesisofLargePlasmidsUsing PyrobestDNAPolymerase 1a,1b 1a,1b,2 2 2 ZHUDa-xing ,ZHOUQing-hua ,WANGYan-ping,CHEGuo-wei, 2 2 2 2 TANGXiao-jun,ZHUWen,CHENXiao-he,SUNZhi-lin 1.a.DepartmentofLungCancerSurgery,b.LungCancerInstitute,GeneralHospital,TianjinMedicalUniversity,Tianjin 300052a 2.KeyLaboratoryofLungCancerMolecularBiologyofSichuanProvince,WestChinaHospital,SichuanUniver- sity,Chengdu610041China a [