犬细小病毒DNA疫苗和其实验免疫研究.pdfVIP

犬细小病毒DNA疫茵及其实验免疫研究 邱薇1范泉水1李作生1杨美峰1郑颖1李丽红1王双印1李江1夏咸柱2 (1．成都军区联勤部军事医学研究所成都650032；2．解放军军事医学科学院军事兽医 研究所长春130062) I／BamH 物经纯化和Not I双酶切后与同样处理的真核表达载体pIRES进行连接，转化到感 犬分别接种不同剂量的plRESVPl或空质粒及生理盐水，8周接种一次，每次接种前采血，测 定血清的血凝抑制效价，第二次免疫后即可检测到较高的血清效价。在第三次接种4周后， 对全部实验犬进行攻毒，攻毒后第7d及14d时采血，测定血清的血凝抑制效价。所有接种 发病。本研究证明了所构建的核酸疫苗(plRESVPl)能使犬免受犬细小病毒强毒的感染。 关键词：核酸疫苗犬细小病毒免疫 犬细小病毒(canine 性细小病毒，病毒粒子小，元囊膜，属单链DNA病毒。CPV属猫细小病毒亚群，感染犬，在 幼龄犬中引起严重的肠炎，在新生幼犬中引起心肌炎。CPV和猫泛白细胞减少症病毒 (FPV)的核衣壳蛋白的氨基酸序列有98％的同源性【101，由于高度的同源性和近年来犬病 J。 部抗原决定基都在VP2中，VPl特有区域中还发现一个T一细胞表位H acid 核酸疫苗(nucleic 原的编码基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内， 通过宿主细胞的转录系统，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，诱 导宿主产生细胞免疫应答和体液免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。NAVs诱导 体液和细胞免疫，不复制，不感染宿主，易于生产以及在室温下长期稳定，还提高了毒株间 的交叉保护且保持病毒抗原的天然形式【6】。这些性质使NAV比常规疫苗和重组疫苗更优 越，具有控制人和动物传染性疾病的潜力。核酸疫苗已实验性地用于鼠，以抗各种病毒和 人的肿瘤相关抗原，包括：流感病毒、人I型免疫缺陷病毒、狂犬病病毒、人类乙型肝炎病毒、 牛疱疹病毒l、人癌胚抗原以及淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒。 213 传统的灭活和致弱的活病毒(MLV)CPV疫苗含整个病毒粒子，这两种疫苗有较大的免 CPV疫苗克服了部分母源抗体问题，小剂量疫苗就可产生更高效的免 疫原性，新一代MLV 疫‘6’7‘8】。研究其它CPV疫苗的还有：利用杆状病毒表达系统的重组疫苗一1和合成肽疫 苗¨仉1¨，这些疫苗与佐剂一起接种犬后，可诱导抗CPV的免疫保护。但NAV有避免应用有 毒佐剂的优点，另外，重组疫苗只激发一次免疫反应，需多次接种才能获得保护，而NAV可 持续表达CPV病毒抗原，可产生比重组疫苗更好的免疫反应。合成肽疫苗局限于限制了抗 原的表位，而CPV的NAV表达天然、完整的病毒抗原蛋白，能更好地刺激免疫系统。本研 导犬产生较高的免疫反应，使其能够抵抗强毒的攻击，现报告如下。 1．材料与方法 1．1试剂、细胞株及动物 I、Not 限制性核酸内切酶BamH I及T4DNA连接酶购自大连宝生物公司。plRES载体 由本实验室保存。DNA胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。大肠杆菌JMl09 感受态细胞由本实验室制备。猫肾(1：81)细胞、CPV毒种由本实验室保存。6只混合饲养 的CPV血凝抑制效价≤2的昆明犬为市售。 、1．2引物 根据文献合成一对引物，上游引物中含BamHI限制位点，下游引物中含NotI限制位点， 引物由上海生工合成。引物序列如下：P1 AGGTA一 5’一GTGCGCCCGCTACTI’GATA’I℃TAATAAAC-3 3．P2 0 1．3方法 1．3．1 CPV病毒DNA的制备用从感染犬粪便中提取的CPV一2b型病毒接种猫肾 EDTA溶液中，于一20℃冻存。 Tris(PH8．0)lmM 1．3．2目的基因的