腹泻性贝毒软海绵酸间接竞争酶联免疫学检测方法地研究.pdfVIP

资源、五不境与可持续发展 腹泻性贝毒软海绵酸间接竞争酶联免疫学检测方法的研究 柳俊秀 摘要：本实验建立了赤潮藻毒素腹泻性贝毒软海绵酸(okadaicacid，OA)的竞争酶联免疫检测方 法。在包被抗原浓度为1．25ug／L、单克隆抗体工作稀释度为l：20000、酶标二抗工作稀释度为1：5000、 OA浓度在200--0．078 ng／ml、显色底物为四甲基联苯二胺(TMB)，采用间接竞争酶联免疫反应对OA 检测限(抑制率为20％时的毒素浓度)约为0．45 ng／ml，在加标浓度为12．5～500ng／ml时，回收率为 87．47-96．59％，变异系数为0．54％～8．75％。因此，该方法可满足海产品中贝类样品OA限量标准检测。 关键词：腹泻性贝毒素；软海绵酸；OA；酶联免疫；id-ELISA 1． 前言 近20年来，有害赤潮在全球范围内频繁爆发，其中有毒赤潮和藻毒素问题目渐突出。赤 潮藻毒素通过食物链传递，在鱼、贝类体内累积，会造成严重的海产品食用安全问题。由这 类海洋生物毒素引起食源性中毒事件已经引起了各国的关注，因此国内外纷纷对各种毒素进 行了多方面的研究，包括结构和功能、毒素生源和检测方法的研究等(易杨华，2004)。腹 shellfish 泻性贝毒(diarrhetic M，et acid，OA)及其衍生物DTXs(LINCOLNa1．2002)。DSP引起的中毒症状包括腹泻(92％)、 且无有效药物治疗(Yasumoto，et a1．1978)。 目前，用于OA和DTXs检测的方法主要有小鼠腹腔注射法、酶联免疫法、细胞毒性测试 法、酶活力抑制分析法、高效液相色谱法以及液相色谱．质谱联用等方法(MORTON SL，1996)。酶联免疫法是利用抗体和抗原的特异性结合反应建立的免疫化学方法，灵敏度高， 特异性强，仪器设备简单，样品前处理过程简单，特剔适于现场监测和大量样本快速筛查， 近年来在分析化学领域受到高度重视并得到迅速发展(朱立平，2000；焦奎，2004)。本实 验室已经成功制备出OA的单充隆抗体，本研究利用得到的单克隆抗体初步建立了检测OA的 间接竞争酶免疫学检测方法，为研制具有自主知识产权的相关检测试剂盒奠定了基础。 2009年上海研究生学术论坛 2． 材料与方法 2．1试剂及仪器设备 四甲基联苯二胺TMB；H202；2MH2S04；甲醇。以上化学试剂均为国产分析纯。 聚苯乙烯96孔酶标板(可拆卸与不可拆卸)；单通道及八通道连续可调移液枪；37℃恒 温箱；BIO-TEK酶标仪；FJ·200高速分散均质器；离心机；旋转蒸发仅。 2．2棋盘法确定抗原、抗体最适工作浓度 体稀释成l：5000、1：1 度梯度。结果判定主要以酶标仪读取各孔OD450值，OD450值为2．O左右，抗原抗体用量较少， 即为抗原抗体最适工作浓度。 2．3 OA溶解液甲醇含量对id-ELISA的影响 O％、15％、 在以上实验的基础上，一抗和甲醇同时加入，每孔甲醇终浓度设置为0、5％、1 根据0D450值的大小进行判定甲醇对免疫反映的影响。 同时用甲醇溶解OA后和一抗同时加入，OA浓度为1：8000；甲醇设置三个浓度组， 使每孔甲醇的终浓度为20％、30％、40％。另设一组不加OA的作为阴性对照组。显色后 择最佳的OA稀释液。 2．4一抗、二抗反应时间对OA竞争抑制id-ELISA的影响 min、120 将一抗的保温时间设为30rain、60min、90 min四组，每组3个平行，二抗反 应时间固定为60rain。测定OD450值，选择最佳一抗反应时间。固定此最佳的一抗反应时 min、90min、120 间，将二抗反应时间设为30rain、60 min四组，每组3个平行，重复以上 实