多耐药肺炎克雷伯菌喹诺酮类耐药相关基因的研究.pdfVIP

多耐药肺炎克雷伯菌喹诺酮类耐药相关基因研究 糜家睿黄支密糜祖煌 江苏大学临床医学院江苏镇江212013 解放军第98医院检验科浙江湖州313000 无锡市克隆遗传技术研究所生物信息学室江苏无锡214026 Klebsiella 【摘要】目的：为了了解多耐药肺炎克雷伯菌(Multi-Drug-Resistance 介导的耐药相关基因进行检测和分析。结果：25株中，有19种存在gyrA基因突变(76％)： 9株存在aac(6’)一I MDRKP菌中，gyrA基因突变是喹诺酮类耐药的主要原因。 【关键词】：肺炎克雷伯菌；喹诺酮；耐药基因 Klebsiella 近年来，多耐药肺炎克雷伯菌(Multi—Drug-ResistancePneumoniae，IlDRl(P) 的耐药状况日趋严重，新的耐药基因不断被发现[1】。先前，我们已经对一组25株MDRKP菌进 行了B一内酰胺类、氨基糖苷类的耐药相关基因研究[z，3】。该组MDRKP菌对喹诺酮类耐药也十 分严重。因此，我们对该组菌进行了染色体介导的喹诺酮类耐药机制(gyrA基因突变)、质粒介 导的喹诺酮类耐药机制(qnrA、qnrB、qnrS、aac(6’)一Ib—Cr、qepA基因)以及多药外排基 因mdfA研究。现报告如下。 1材料与方法 1．1菌株来源及鉴定25株试验菌株均分离自解放军第九十八医院2005年9月至2006年 4月住院患者送检的25份标本，分别来自痰液15份，尿液4份，创伤伤口分泌物3份，咽拭 子、静脉血、脑脊液各1份。25株菌分别来自6个病区，其中18株分离自创伤患者送检的不 同种类标本：痰液8份，尿液4份，创伤伤口分泌物3份，咽拭子、静脉血、脑脊液各1份。采 20 用法国生物梅里埃公司API E系统鉴定菌种。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃 希菌ATCC35218(由浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所俞云松教授惠赠)、铜绿假单胞 茵ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC700603。 1．2药敏试验系微量肉汤法。采用法国生物梅里埃公司产品ATB?G-5药敏试验板，共 诺明(TSU)、环丙沙星(CIP)。根据(CLSI)／NCCLS2005年版标准规定的临界值判定药敏结果 [4]。 u 的模板液，一20℃冰箱保存备用。 1．4基因检测均为PCR法，靶基因引物序列和目的产物长度见表1。各种靶基因PCR 127 u Il ll 扩增体系均为：每反应体系P1引物11(1．0umol／L)、P2引物11(1．0mol／L)，dNTPs 2 II l(KCl 2mmol／ p1(2mmol／L)，10倍缓冲液2 10mmol／L，(NH4)2S048mmol／L，MgCl2 DNA L，Tri 0．5％，BSA0．02％(wt／v01))，Taqpol1U(不计体 s—HCI(pH9．0)lOmmol／L，NP40 u lI vl。PCR扩增热循环参数为：93C预变性2min， 积)，超纯水9 l，模板液51，总反应体积20 35周期，最后一个72℃延长至5min。产物经2％琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的 目的条带为阳性。检测试剂盒和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供。 表1靶基因PCR引物序列 基因名称 引物序列(5’一3’)