诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经元样细胞地研究.pdfVIP

诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经元样细胞的研究 李晓丰辽宁省血液中心输血医学研究所辽宁沈阳，110044 摘要 目的：优化“序贯诱导法”实验条件，建立一种稳定、高效、简便的实验方法，将小鼠胚胎 干细胞诱导分化为神经元样细胞。 方法：在饲养层细胞上培养小鼠胚胎干细胞，优化“序贯诱导法”的实验条件，对诱导后细 胞进行成熟神经细胞标志物鉴定，并用流式细胞仪测定诱导分化比率。 结果；1．生长于饲养层上的未分化小鼠胚胎干细胞聚集呈圆形或椭圆形集落样生长，细胞 排列紧密，集落边界清楚。诱导分化的细胞于第2天出现一定的形态变化，细胞呈多角形， 随后，逐渐伸出突起，向四周伸展，与邻近分化细胞交织成网状，出现突触样结构和生长 端样结构，形似神经元。2．优化后的“序贯诱导法”在诱导时首次接种所用培养液的血清浓度 印记法检测TU儿表达阳性。4．流式细胞仪检测NeuN阳性细胞百分比，计算出诱导第lO 天分化比率为89．9l％士2．03％。 结论：应用优化后的“序贯诱导法”，可稳定、简便的诱导小鼠胚胎干细胞高比率分化为神 经元样细胞。 关键词：胚胎干细胞：神经元；诱导分化 stemcells，ESCs)来自囊胚内细胞团，在体外可长期自我复制，并且 胚胎干细胞(Embryonic 具有分化出内、中、外三个胚层细胞的多潜能性。很多研究表明ESCs可在体外被定向诱导分化为 神经细胞。但是，目前其分化机理还不清楚，体外诱导其分化的过程很难控制，采用的分化步骤多 是经验性的，诱导分化的比率也都相对较低，大约在50％一70％左右【l。3J，干细胞等未分化或低分化 细胞混杂现象依然存在，严重制约着临床应用。因此如何在体外定向、高效、稳定地诱导ESCs向 神经细胞分化是解决这一问题的首要关键，也正是本领域难点之一。 本研究优化“序贯诱导法”实验条件，将小鼠胚胎干细胞向神经干细胞／神经前体细胞及成熟神经 元样细胞方向诱导分化，期望能够建立一种更高效、稳定、简便的诱导方法，为进一步研究胚胎干 细胞向神经细胞分化的确切作用机理打下基础，能够使胚胎干细胞早日应用于临床。 材料与方法 一，试剂与仪器 1．各种培养液组分 15％胎牛血清(Hyclone)、O．1mM bFGF(Sigma)。 2．主要仪器设备： CK40)：荧光显 BX51)：水平琼酯糖电泳仪(北京六一)；垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(北京六一)： 微镜(Olympus 1．15)；电子分析天平(Sartorius)；低温高速离心机(Sigma3—16K)；C02 小型台式离心机(Sigma ，314． 孵箱(HeraFilter)。 二、实验方法 1．饲养层细胞制备 采用原代小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)作为饲养层。无菌取孕13．5天鼠胚(孕鼠由中国医科 大学动物部提供)，去头、尾、四肢和内脏，剪碎，O．25一乞胰酶．EDTA消化30分钟，应用PMEF培 C，Roche)， 养液，37C、5％C02培养。使用第24代状态好的PMEF，加入1099／ml的丝裂霉素C(Mit 作用2．5小时，充分洗涤后可用于接种使用。 2．mESCs培养及诱导分化 细胞上，每隔24．48小时换液，每3-4天以1：4．1：6传代。当细胞达80％融合时，用胰酶消化成单细 胞悬液，接种于原培养瓶中，使用PMEF培养液，37‘C孵育2小时，离心以去除PMEF，计数后重 新接种子无饲养层、无包被的6孔培养板中(Coming 养，记为第l天。以后每24-48小时进行换液，逐渐更换为完全使用无血清添加bFGF的NC培养液， 再继续每48小时换液一次，直至第10天。 3．优化“序贯诱导法”的诱导分化条件 为了能够更高效、稳定的诱导mESCs分化为神经元样细胞，我们进行了诱导条件的优化。在诱 导时均使用六孔培养板，每次只改变一个条件，保证其余条件不变。 (1)诱导时首次接种所j{j培养