COLD-PCR和高分辨率溶解结合使用,高效筛查鉴定癌症基因低水平的未知突变.pdfVIP

COLD-PCR和高分辨率溶解结合使用，高效的筛查和鉴定癌症基因低水平的未知突变 研究背景： 癌症中体细胞分子层面的突变，常常需要在大量野生型DNA 中辨识低浓度的DNA 突变。 但是，突变检测方法的选择率和灵敏度常常限制了鉴定低浓度突变的可靠性。最近开发的 COLD-PCR （低变性温度下的复合扩增，李等人。2008 ）解决了低含量基因突变检测的一些 局限性，在PCR 扩增过程中利用关键变性温度丰富含有突变的扩增子，不论突变位于序列 的什么地方。COLD-PCR 的一个主要属性是富集突变体以便于在PCR 后的直接测序。然而 碱基测序仍然是昂贵的选择，从而通过高通量扫描序列预检是有吸引力的办法。高分辨率融 解（HRM ）是一种可用于预筛查测序之前未知突变的技术，但不能确定具体的检测基因突 变的身份。因此，为了富集、快速筛查和鉴定低浓度的未知突变，我们把HRM 突变扫描和 COLD-PCR 相结合，随后进行已知突变的直接测序鉴定。 方法： 一系列稀释的HCC2157 细胞系和SW480 (ATCC)细胞雄株基因组DNA 准备用于评估方法 的灵敏度。TP53 基因的外显子7 和8 通过常规PCR 和COLD-PCR 进行扩增。COLD-PCR 使用较低的变性温度（低于扩增变性温度~1 ℃）来优先扩增在序列上含有突变的DNA 。使 用Cepheid SmartCycler II PCR 仪。对PCR 扩增产物中存在的突变随后通过HRM 在 LightScanner HR96 (Idaho Technologies Inc.)上进行筛选。扩增产物在美国Dana - Farber 研究 所分子生物学的核心机构进行测序，验证突变的位点和类型。这种方法使用人类肺腺癌手术 的DNA 样本进行评价。 系列稀释为检测HRM 灵敏度 常规PCR 扩增子的HRM 分析，具有一个突变检测极限，4.0%到10.0% （外显子7 ）。( 图 1A) COLD-PCR 扩增子的HRM 分析，具有一个突变检测极限，0.25%到1.0% （外显子7 ）。( 图 1B) 这证明通过COLD-PCR-HRM 方法进行检测, 比常规PCR-HRM 法灵敏度提高了10-20 倍 TP53 基因外显子7 比外显子8 的扩增效率低,这是由于两者存在不同的熔化区域.(数据没列 出) 肺肿瘤的HRM 分析 TP53 基因第7 外显子，常规PCRP-HRM 和COLD-PCR-HRM 两种方法都发现所有7 种已知 突变，（图2 ）两种方法均有野生对照组。 TP53 基因第8 外显子，常规PCR-HRM 可靠地检测出6 个低含量的突变，但3 个得分为“未 知”，这表明可能存在突变。 COLD-PCR 扩增产物的HRM 分析确认了所有的9 种低含量的突变，（图3 ）包括通过常规 PCRHRM 分类为“未知” 的三种突变。 序列分析： 这里评价的16 个突变，半数无法通过常规PCR 的扩增产 物可靠地测序确定 COLD-PCR 扩增产物的序列分析准确定义外显子7 里94% 的突变和100%的外显子8 突变。代表测序图见图4 。 尽管通过COLD-PCR 对突变进行富集，一个突变（样本TL78 ）不能通过测序来鉴定，可 能是目前是TP53 基因外显子7 的扩增产物中突变检测的底限。我们推测TL78 的突变在野 生等位基因间的小于1%。 结论： 1. COLD-PCR 检测技术增加了HRM 的检测能力，随后能够通过阳性突变样品的测序，鉴别 低含量突变的位点和类型。这大大方便了具有临床意义的潜在低浓度突变的评价。 2. 这种方法的优势同样体现在COLD-PCR 扩增产物的直接测序上。远低于标准测序灵敏度 水平的低浓度突变在COLD-PCR 扩增后可以很容易的被鉴别。 3. 使用这种改进的方法，我们证明COLD-PCR-HRM 有潜力作为一种结合了速度、易用性、 低成本、灵敏度和识别未知低浓度突变位置和类型的能力的常规诊断筛查工具。