《现代生命科学研究技术》实验指导-EMSA验证蛋白与DNA的结合-笔记版.pdfVIP

1  现代生命科学研究技术实验指导   利用凝胶阻滞实验（EMSA）验证蛋白与 DNA 的结合 一、实验原理及应用 凝胶阻滞实验（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA），是一种研究蛋 白和核酸相互作用的技术。蛋白质与放射性标记或生物素标记的探针结合后， 形成的复合物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率比自由探针的迁移率大 大降低，表现为条带滞后。 凝胶阻滞实验具有简单、快捷、灵敏等优点，可用于检测 DNA 结合蛋白、 RNA 结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体来进一步确定阻滞条带所结合的蛋 白质。结合定点突变技术，还可以用来研究蛋白结合核酸的关键位点。 许多生物学过程，如染色体的包装、维持及控制，都与蛋白质-DNA 间的 非特异性相互作用有关。在古菌中发现的某些小分子量 DNA 结合蛋白具有与组 蛋白类似的功能，按分子量不同分为 7kDa、8kDa 和 10kDa 三类。本实验中所 用的蛋白质 Sul7d 是来源于嗜酸热硫化叶菌 （Sulfolobus acidocaldarius）中的 7kDa 蛋白，能够和 DNA 非特异性结合。本实验中利用 EMSA 实验验证体外表达的 Sul7d 蛋白和 DNA 的相互作用。60 bp 的 DNA 片段由公司合成。部分 DNA 片 段由生物素标记。将纯化好的 Sul7d 蛋白与 DNA 底物共孵育，然后进行非变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳；将凝胶上的样品转移到 NC 膜，利用显色剂显影后即观 察到目标蛋白与不同结构底物的结合情况。 生物素标记法采用随机引物标记法，利用 DNA 聚合酶，以目标 DNA 为模 板，以随机引物为起始引物，将生物素标记的 dUTP 引入到合成的 DNA 探针中， 产生高活性生物素标记的 DNA 片段。生物素标记相对于同位素标记，操作方便、 安全。 为了获得准确的实验结果，还应该在蛋白质-核酸混合液中分别加入不同浓 度的“竞争剂” （competitor）。竞争剂与探针序列相同，但没有被标记。如果被 检测的滞后条带随“竞争剂”浓度增加而逐渐减弱，说明蛋白质和探针之间的 结合是特异的。   EMSA 验证蛋白与 DNA 的结合 2  现代生命科学研究技术实验指导   二、实验材料、试剂、仪器 1.实验材料： （1）纯化好的目标蛋白 Sul7d(4mg/ml) （2）具有特定序列的寡核苷酸双链（由公司合成），60 bp 左右 2.试剂： （1）非变性聚丙烯酰胺凝胶试剂，胶浓度为 5%，现用现配。 （2）DNA 片段标记试剂盒（如生物素化标记） （3）寡核苷酸纯化试剂盒 （4）5×蛋白-DNA 结合缓冲液： 100%甘油 500 μl 1 mol/L Tris(pH8.0) 250 μl BSA(10 mg/ml) 125 μl 5 mol/L NaCl 30 μl 0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 10 μl 1 mol/L 二硫苏糖醇（DTT） 10 μl H2O 75 μl 总体积： 1000 μl O 配制。 （5