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微生物采油菌种室内筛选与评价技术研究 摘要：针对中原油田油藏的三高特点（高温、高压、高盐），应用微生物室内富集培养与分离纯化技术，筛选出具有应用潜力的四株微生物采油菌种。室内评价表明，四种微生物可耐受90℃高温、15MPa压力、10×104mg/L矿化度，在液体培养过程中均能产生表面活性剂和有机酸，C11以下低碳烷烃不能被细菌利用。对高粘度原油降粘率高达68%，低粘度原油作用不大，最高降粘率16.1%，具有矿藏应用价值。 关键词：微生物采油；中原油田；菌种筛选；性能评价 引言： 微生物采油技术目前在世界各国得到普遍研究与应用[1,2]。其主要机理是降解原油，并代谢产生有利于提高采收率的表面活性剂、有机酸、气体等。现在市场上一般采油用微生物的适用油藏温度在40~60℃、矿化度小于5×104mg/L，不适合中原油田油藏的三高特点（地层温度75~140℃、油藏饱和压力10~25MPa、矿化度7~32×104 mg/L）。为此中原油田与山东大学微生物技术国家重点实验室合作开展了适应于中原油田地质特点的采油用微生物菌种筛选与评价工作，并获得四株具有应用价值的微生物采油菌种。 1 微生物室内筛选与鉴定 1.1菌种来源 样品为73个中原油田污水、炼油厂废水样和28个含油污泥样。 1.2培养基组成与配制 1.2.1分离降解石油微生物的无机盐溶液 NaCl0.5%，（NH4）SO40.1%，MgSO4．7H2O0.025%，NaNO30.2%，KH2PO40.5%，K2HPO4．3H2O1.0% 1.2.2以原油为碳源的液体培养基 在50ml厌氧培养瓶中加入原油0.2g，按厌氧液体培养基制备方法[3,4]分装无机盐溶液10ml，120℃蒸汽灭菌20min，然后用无菌注射器注入2mlATS溶液和0.2ml1.0%Na2S和NaHCO3溶液。 1.2.3以原油为碳源的固体培养基 无机盐溶液添加酵母膏0.1%，原油4.0%，琼脂2.0%，调pH值为7.0-7.2，0.1MPa灭菌20min。 1.2.4以葡萄糖为碳源的固体培养基 无机盐溶液添加酵母膏0.1%，葡萄糖2.0%，琼脂2.0%，调pH值为7.0-7.2，0.7-0.8MPa灭菌20min。 1.2.5以葡萄糖为碳源的液体培养基 无机盐溶液添加酵母膏0.2%，葡萄糖2.0%，调pH值为7.0-7.2，0.6-0.7MPa灭菌20min。 1.3厌氧菌种的富集配养与分离纯化 1.3.1将适量的污水或土样及原油0.2g放入厌氧培养瓶中（每个样品做0%和10%两个矿化度 ），按严格厌氧操作取适量无机盐溶液，40℃或60℃（下同），200~250rpm摇床培养7天。 1.3.2　0.5ml上述培养液注入以原油为碳源的厌氧液体培养基，相同条件培养7天。 1.3.3　对1.3.2进行NO2-1离子检验[4]，若有红色反应，则取其培养液0.5ml稀释到一定程度，在葡萄糖培养基上涂布，放入真空干燥器内，真空脂密封抽真空30min，然后充入高纯氮气，再抽真空10min，重复四次，使干燥器保持-0.02MPa的真空度，相同温度恒温培养3天， 1.3.4取不同形态的菌落在葡萄糖固体培养基上划线，反复抽真空充氮气，厌氧条件恒温培养。如此反复几次，直到菌落形态一致。 1.3.5将划出的不同菌落在原油为碳源的固体培养基上划线，抽真空充氮气，厌氧培养7天，所得菌落既为纯化菌种。 1.3.6挑取纯化的菌落分别接种在好氧、厌氧两种条件的原油液体培养基中，200~250rpm摇床培养，观察其原油降解的情况，将能降解原油的菌种保存在葡萄糖斜面上。 通过以上方法获得四株可降解原油的兼性厌氧菌种，分别是SDB-1、SDB-2、SDB-3、SDB-4 。 1.4菌种扩大培养小试研究 1.4.1摇瓶实验 ⑴ 培养基配方的确定：采用正交实验法确定碳源、氮源、磷源的种类及浓度。 ⑵ 摇瓶工艺参数的确定：固定摇瓶及装量，变换不同接种量、摇瓶转速及培养时间，进行生长曲线的测定，进而确定摇瓶最适工艺参数。 1.4.2 10L及50L发酵罐工艺参数的确定 采用德国B.Braun公司生产Biostat系列微机控制自动发酵罐。10L发酵罐工艺参数参考摇瓶工艺参数，通过分批发酵实验定时取样，测定菌数及活性，确定接种量、通气量、搅拌转速、消沫剂浓度、培养时间等参数。50L发酵罐工艺是在10L发酵罐工艺参数的基础上进一步实验获得的，表1是50L发酵罐工艺参数。 表1 50L发酵罐工艺参数 菌号 接种量 通气量（v/vmin） 搅拌时间（rpm） 消