浓缩单宁合成的分子调控及紫花苜蓿遗传转化研究.pptVIP

浓缩单宁合成的分子调控及紫花苜蓿遗传转化研究 姓名：xxx 紫色苜蓿的一般介绍 紫花苜蓿(Medicago sativa L.)草质优良、营养丰富、适口性强，被誉为“饲草之王”，是亚洲、北美洲利用最广泛、最重要的豆科牧草。然而，反刍牲畜采食新鲜苜蓿后易引起膨胀病(bloat)，影响到它在放牧方面的利用。一般认为，苜蓿叶片中浓缩单宁(condensed tannins，CT)含量低是引起反色牲畜膨胀病的主要原因。通过遗传调控，促使叶片中CT合成和积累是苜蓿遗传育种的重要研究内容，具有重要的理论和实践意义。 紫色苜蓿的一般介绍 膨胀病的发生机制 膨胀病(bloating)是一种反当家畜消化系统失调的疾病。反当牲畜采食新鲜首蓓在瘤胃中会被快速消化，细胞破裂，细胞内含物，尤其是可溶性蛋白在采食后很短的时间里释放出来，在微生物作用下，致使瘤胃里蓄积由气体、泡沫、砧液和部分消化了的颗粒状植物材料形成的厚而粘稠的半固态多泡沫复合体，这种半固态多泡沫复合体进一步吸附由微生物发酵产生的气体。这种混合型气体难以通过打隔排出牲畜体外，随着发酵气体的不断产生，瘤胃逐渐膨胀起来，膨胀的瘤胃上顶胸隔膜阻止呼吸，使牲畜在很短的时间里窒息、死亡 浓缩单宁的抗膨胀机理 CT中的轻基有与其他化合物形成氢键的强烈趋势，它可与蛋白质上的多个位点相结合，使蛋白质的空间构像发生改变，从而阻止了蛋白质在消化道内被降解。另外，CT可直接作用于水解酶，使其活性丧失。CT与蛋白质的复合物很稳定，在pH为4.5一7.0时仍以沉淀形式存在这种复合物可能在pH更低的皱胃和具有碱性环境的小肠中分解。同时，研究人员还发现单宁对不同蛋白质和氨基酸结合能力不同，它易于和富含脯氨酸(Pro)的蛋白质结合，如它能和唾液粘蛋白优先结合，而牛羊不能分泌这种唾液粘蛋白，故反当动物饲料中的单宁可与日粮蛋白结合，这为减少朦胀病的发生提供了保护屏障。 研究的意义 长期以来，因反当动物采食新鲜苜蓿引起膨胀病限制了这一优良牧草的直接利用。到目前为止，采用常规杂交或诱变育种手段尚未选出这样的品种。其原因可能是CT含量为隐性基因所控制，而隐性基因只有在纯合时才可表现，致使选择效率极低。利用原生质体融合技术将CT含量高、不致朦胀病的豆科牧草基因组导入首蓓之中，但该技术的最大缺点是再生频率太低，难以在育种实际中应用。利用基因工程技术提高首蓓CT的合成水平，育成不引起朦胀病的首楷品系是培育不引起朦胀病首蓓品种的新的尝试。 技术基础 CT生物合成途径是一个较为复杂的过程，有多个酶参与其合成代谢途径，其中二氢黄酮还原酶 (dihydroflavonol reduetase，DFR)为CT合成途径的限速酶，调控DFR基因表达水平将是增加CT含量的关键所在。但植株内过高的单宁含量会造成饲草适口性差而且会降低牲畜对蛋白的利用效率，在转DFR基因的苜蓿中还须考虑将CT积累控制在适度的水平，以免造成适口性和降低营养价值，这就需要将DFR基因置于特定的启动子控制之下，达到限量、定位表达。 研究的内容 (1)PNZIP基因启动子的克隆和组织特异性、活性鉴定:从裂叶牵牛中克隆PNZIP启动子，以GFP做为报告基因构建PNZIP启动子驱动的植物表达载体，在模式植物烟草中鉴定PNZIP的组织特异性和活性。 (2)DFR基因的克隆及对CT合成的调控效果鉴定:从蒺藜苜蓿中克隆DFR基因，构建原核表达载体进行原核表达，验证基因编码序列的完整性。构建PNZIP启动子和组成型CaMV35S启动子驱动的DFR基因植物表达载体，遗传转化烟草来鉴定DFR基因在高等植物中的表达活性，验证通过DFR调控CT生物合成和积累的可行性。 (3)农杆菌介导的PNZIP启动子驱动的DFR基因遗传转化紫花苜蓿的研究:通过农杆菌侵染系统、培养基及抗生素的筛选来优化转化系统获得较高频率的转化体系。 技术图谱 缩合单宁的合成过程 结论 本项目针对苜蓿作为鲜食牧草容易发生膨胀病问题展开研究，对膨胀因子CT的生物合成及在分子水平的调控开展了一系列与CT生物合成相关基因克隆、表达及控制CT表达水平和位点的组织特异启动子的相关试验，取得的主要结果有: 结论 1.采用RT-PCR方法从蒺藜苜蓿(Medicargo trunctula L.)幼果中克隆到二氢黄酮还原酶(DFR)基因cDNA片段，分子大小约 1018bp。与GenBank中已注册的DFR基因同源性为99.8%，翻译序列表明此序列编码337个氨基酸，编码分子量为 39.8kDa的酶蛋白分子。在此基础上利用DFR基因PCR引物中设计的BamHI和SacI酶切位点，将DFR基因成功插入到pET28a(+)的T7启动子和终止子之间，构建携带6xHis标签的原核表达载体pETDFR。SDS一PAGE电泳鉴定DFR基因