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生物化学实验一：可溶性糖的硅胶G薄层层析 指导教师：李玉芹 一、 目的 1. 学会薄层板的制备方法和薄层层析操作。 2. 学会比移值Rf的测定方法 二、 原理 层析法又叫色谱法，是分离、提纯和鉴定混合物各组分的一种重要方法，有极广泛的用途。它是一种物理化学分离方法，利用混合物各组分的物理化学性质的差异在两相间的分配比不同而进行分离。其中一相是固定相，另一相是流动相。常用的色层分离法有薄层层析、柱层析、纸层析和气相色谱法等。 薄层层析(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，兼有柱层析和纸层析的优点，是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的分离方法。它是将吸附剂(固定相)均匀地铺在一块玻璃板表面上形成薄层(其厚度一般为0.1mm～2mm)，在此薄层上进行色谱分离。由于混合物中的各个组分对吸附剂的吸附能力不同，当选择适当的溶剂(被称为展开剂，即流动相)流经吸附剂时，发生无数次吸附和解吸过程，吸附力弱的组分随流动相向前移动，吸附力强的组分滞留在后，由于各组分具有不同的移动速率，被流动相带到薄层板不同高度，最终得以在固定相薄层上分离。这一过程可表示为： 化合物在固定相K化合物在流动相平衡常数K的大小取决于化合物吸附能力的强弱。一个化合物愈强烈地被固定相吸附，K值愈低，那么这个化合物随着流动相移动的距离就愈小。 薄层层析除了用于分离外，更主要的是通过与已知结构化合物相比较来鉴定少量有机物的组成。此外，薄层层析也经常用于寻找柱层析的最佳分离条件。试样中各组分的分离效果可用它们比移值Rf的差来衡量。Rf值是某组分的色谱斑点中心到原点的距离与溶剂前沿至原点距离的比值，即Rf=ab，Rf值一般在0～1之间，当实验条件严格控制时，每种化合物在选定的固定相和流动相体系中有特定的Rf值。Rf值大表示组分的分配比大，易随溶剂流下。混合样品中，两组分的Rf相差越大，则它们的分离效果越好。应用薄层层析进行分离鉴定的方法是将被分离鉴定的试样用毛细管点在薄层板的一端，样点干后放入盛有少量展开剂的器皿中展开。借吸附剂的毛细作用，展开剂携带着组分沿着薄层缓慢上升，由于各组分在展开剂中溶解能力和被吸附剂吸附的程度不同，其在薄层板上升的高度亦不同，Rf也不同。混合样中各组分可通过比较薄层板上各斑点的位置或通过Rf值的测定来进行鉴别。如果各组分本身带有颜色，待薄层板干燥后会出现一系列的斑点；如果化合物本身不带颜色，那么可以用显色方法使之显色，如碘熏显色、喷显色剂或用荧光板在紫外灯下显色等。 Rf =原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf 值是常数。Rf 值的大小与物质的结构、溶液系统的性质、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。 三、 实验材料、主要仪器和试剂 硅胶G薄层板、毛细管、层析缸、电吹风、喷雾器、烘箱。 试剂：1、1%标准糖溶液 2、扩展剂：氯仿:冰乙酸:水=18:21:3 3、苯胺-二苯胺-磷酸显色剂：2g二苯胺，加2ml苯胺，10ml 85%磷酸，1ml浓盐酸，100ml丙酮溶解混匀 四、操作步骤 1、活化：硅胶板用前放入110℃烘箱中活化30分钟。 2、活化后的硅胶板室温冷却后，在距底边2cm水平线上确定5个点，用毛细管吸取糖溶液，轻轻接触薄层表面，每次加样后原点扩散直径不超过3mm，干后再点一次。 3、展层：将薄板有样品的一端浸入扩展剂，扩展剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔秒出溶剂前沿界线，用热风吹干。 4、显色：用喷雾气均匀喷上显色剂，在85℃下烘干，即可显出各层析斑点。 五、薄层层析操作要点1、铺板 纹；过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G:水=1：2～3，硅胶G:羧甲基纤维素钠水溶液=1:2。研磨匀浆的时间，根据经验来定，与空气湿度有关，一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断，越稠越难下滴。匀浆的稀稠除影响板的平滑外，也影响板涂层的厚度，进一步影响上样量。涂层薄，点样易过载；涂层厚，显色不那么明显。通常，板的质量对薄层鉴别的影响不是很大，影响最大的是展开剂的配制和展开系统的饱和。 点样 尽量用小的点样管。如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。这样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。样品溶液的含水量越小越好，样品溶液含水量大，点样斑点扩散大。样品溶液的溶剂一般是无水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干。 展开剂配制 选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗，强烈振摇使混合液充分混匀，放置，如果分层，取用体积大的一层作为展开剂。绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开剂。混合不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。各