传染性法氏囊病毒超强毒株高免蛋黄抗体的研制及应用.pdfVIP

禽的传染病 传染性法氏囊病毒超强毒株高免蛋黄抗体的研制及应用 2 陆冰洋，刘华栋，王彩先，唐娟，詹海杰，詹丽娥 （山西省农业科学院畜牧兽医研究所，030032） 摘 要 本实验用山西某养殖场分离到的传染性法氏囊病毒野毒株，经病料处理以及 PCR 技术鉴定、序列比对，发现 其与国外经典超强毒株的同源性最高达到 99.6%，除 222 位点，其他位点均具备超强毒株的序列特征，结合临床发病 特征，确定其为超强毒株。用此超强毒株研制成 vvIBDV 灭活疫苗，免疫健康鸡群，经三次免疫后用琼脂扩散试验测 定血清和卵黄中的抗体水平，当卵黄中的抗体滴度达到 27 时，收集高免蛋，制备高免卵黄抗体，用此高免卵黄抗体治 疗攻毒 IBD 的鸡群，有效率达到 100%，实验鸡群全部存活。 关键词 传染性法氏囊病毒；超强毒株；VP2 ；卵黄抗体 鸡传染性法氏囊病（IBD ），是目前养禽业最重要的疾病之一。1957 年首次发现于美国东海岸特 拉华州南部冈博罗城的肉鸡群，因此也称“ 冈博罗”病，Wint-orfield 于 1962 年从患病小鸡的鸡胚中分 离出病毒，1972 年定名为鸡传染性法氏囊病[1] 。80 年代以后至 90 年代以来欧洲国家出现了致死率很 高的超强毒传染性法氏囊病毒毒株（vvIBDV ）。几十年来，已遍及几乎所有养鸡国家。我国的周蛟[2] 等人在 80 年代初首先分离到 IBDV ，虽然经过三十年来的预防和控制，但是仍有不同程度的发生或爆 发，给我国养禽业造成巨大损失。由于疫苗的保护率达不到 100%，免疫后的鸡群在遭遇强毒攻击时 仍会发病。用高免卵黄抗体治疗发病鸡群，能够起到立竿见影的效果，而且成本低廉，得到了广泛的 应用。本实验使用从山西某鸡场分离到的传染性法氏囊超强毒株研制卵黄抗体。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病料和种蛋来源 法氏囊病料组织采自 2012 年山西省不同地区发病鸡群。抗原：vvIBD 抗原由本实验室利用 SX/1 2 毒株制备。无特定病原鸡种蛋购自山东 SPF 鸡实验种鸡场。 1.1.2 主要试剂 鼠源反转录酶（M-MLV ）、RNase inhibitor 购自购自 Promega 公司；Trizol、DNA marker 为 TIA NGEN 公司产品；Primer Star HS DNA Ploymerase 购自宝生物工程（大连）有限公司；AxyPrep DN A 凝胶回收试剂盒为美国 AXYGEN 公司产品。 1.2 方法 1.2.1 病料的处理 将采集到的法氏囊病料按 OIE 手册中诊断与疫苗标准部分关于传染性法氏囊病毒处理的标准方 法略加改进，具体方法为：将冻存的病料融化后剪碎，放入研磨器中，加入灭菌 PBS 研磨并加入青链 霉素终浓度为 1mg/ml，得到的悬浊液加入等体积氯仿，充分震荡后置于4 ℃过夜，12000rpm 离心 15 min 将上清移入灭菌的 EP 管中备用。 1.2.2 引物设计与合成 根据 GenBank 登录的 IBDV VP2 基因参考序列设计 VP2 全长基因扩增引物。上游引物 P1 ：5’C GGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACC-3’下游引物 P2 ：5’-CCCTCGAGCACCGGCACAGC TATCCTCCTTAT-3’。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.2.3 病毒 RNA 的提取及VP2 的扩增 对上述上清液用 Trizol 法提取 RNA ，具体步骤为：取 250μl 病毒液加入 750μl Trizol ，震荡混匀， 静置 5min 。加入 150μl 氯仿震荡混匀，4 ℃ 12000r/min 离心 5min 。取上清加入450μl 异丙醇，颠倒混 匀，4 ℃ 12000r/min 离心 12min。弃上清，沉淀中加 1ml 75%DEPC 乙醇洗涤，4 ℃ 12000r/min 离心 5mi