缺氧后不同时间小鼠脑组织提取液诱导人MSCs分化为神经元样细胞实验研究.pdfVIP

筮氢丘丕回吐间尘基堕塑堡堡塾速透昱厶丛S垒金丝塑盟墅丞搓细咆盥塞鳖婴嚣 缺氧后不同时间小鼠脑组织提取液诱导人MSCs分化为 神经元样细胞的实验研究 中山大学附属第二医院儿科 导 师：罗向阳副教授 硕士研究生：康颖 摘 要 研究背景和目的 缺氧是l临床上非常常见的病理表现，可以造成多系统、多器官的损伤，而神经 系统对于缺氧最为敏感。缺氧可造神经细胞不可逆损害，引起一系列的临床症候群， 严重时脑功能活动停止，出现脑死亡。当神经细胞坏死后，由于神经细胞的不可再 生性，即使缺氧等因素去除后，仍可留有神经系统后遗症。国内外主要采用改善脑 循环、促进脑代谢、抗凝及脱水等药物治疗，并从降低神经细胞坏死和凋亡等方面 加强和改进了治疗措施，对缺血半暗带的损伤显示了一定的治疗效果，但不能使己 坏死的神经细胞再生，对于己发生坏死的脑组织，临床疗效不满意。因此，有必要 寻找一种切实有效的修复受损脑组织的治疗方法。 干细胞是具有自我复制，高度增殖及多向分化潜能的细胞群体，一方面可以通 过细胞分裂维持自身细胞群的大小，同时又可以进一步分化成各种不同的组织细胞， 从而构成机体复杂的组织器官。目前，国内外一些研究表明，骨髓问充质干细胞 (MSCs)具有自我更新、高度增殖以及在特定条件下进行多向分化的特性，包括向 神经元样细胞分化的潜能。动物体内实验表明，外源性MSCs不仅可在正常小鼠的脑 内转变为神经元，表达神经特异核蛋白(NeuN)：还可以在脑组织缺血缺氧性损伤的 情况下，在体内诱导分化为有一定功能的神经元细胞。在脑细胞坏死急性期存在氧 自由基、溶解酶、吞噬细胞等，不利于MSCs存活。脑缺氧时，防御和应激反应可触发 和启动一系列内源性神经保护，此时移植可能更有利于MSCs存活增殖及向神经细胞 鲑氢厦丕回堕回』!基堕塑塑堡塾煎透昱厶丛§鱼佥丝盘盟垒丞搓塑堕的塞筮婴窒 分化。但后期胶质瘢痕形成会阻碍神经突起发育，影响神经再生与重建。缺氧后不同 时间脑组织提取液对MSCs有何影响，在脑缺氧性损伤后何时进行移植为最佳时间， 目前国内外鲜有报道。 本课题拟研究对于缺氧造成神经损伤的小鼠，在缺氧后不同时段提取其脑组织 匀浆提取液对MSCs进行诱导，能否将MSCs诱导成为神经元样细胞；及比较不同时 段的诱导液诱导MSCs成神经元样细胞的阳性率，寻找移植最佳时间。为体内实验以 及今后临床移植的开展提供实验依据。 实验方法 一、骨髓间充质干细胞(MSCs)纯化体外和培养 1、MSCs的分离培养及形态学观察 无菌条件下取正常儿童骨髓(自愿供者)2ml，加入含有1．5ml的10％肝素液的离 培养瓶中，37。C、5％C0：、饱和湿度的c吼培养箱中原代培养。倒置相差显微镜下每 日观察1次。72小时半量换液，去除杂质细胞及未贴壁的细胞。约90％贴壁细胞接 近融合时，用PBS冲洗2次以除去培养瓶中的含血清培养基，以适量0．25％胰蛋白 酶一EDTA室温消化，将细胞悬液按l：2或1：3比例传代接种。待传代细胞生长接 近完全融合时，可继续传代。 2、MSCs的鉴定 打成单细胞悬液送流式细胞仪室检测CD34、CD44、CD29。 二、脑缺氧小鼠动物模型的建立及脑匀浆诱导液的制备 1、脑缺氧小鼠动物模型的建立 将6～8周正常成年昆明小鼠(雌性)放入密闭的透明塑料箱中，通含8％0：及 92％N。的混合气体，气体流量为2L／min，箱体的另一端与外界相通，以保持箱内的 压力与大气一致。箱内置钠石灰以吸收小鼠呼出的c0：，水硅胶以吸收水蒸气。通气 2．5小时后，将小鼠放出，恢复正常通气于自然空气中。 2、脑匀浆诱导液的置备 继氢压丕旦堕回尘鼠题组织堡塑速透昱厶丛!鱼坌些塑i±墅丞搓塑照笪塞熊盟童 福尔马林固定，以各制作病理切片用：一侧脑组织称重，按每150ml湿重加lml的 以0．22um微孑L滤膜过滤除菌后制备成诱导液，一20。C冰箱保存备用。使用时37。C水 浴解冻，按20％Et例以L-DMEM培养基稀释使用。 三、MSCs诱导成为神经元样细胞及细胞免疫化学鉴定 1、MSCs诱导成为神经元样细胞 壁生长良好，将12孔板中的含血清的完全培养基吸净，用PBS洗2次，分为三组(A、 B、c