人谷草转氨酶的基因改造及高效重组表达.pdfVIP

中国医药生物技术 2014年 lO月第9卷第 5期 ChinMedBiotechnol，October2014，Vo1．9，No．5 DOI：10．3969／cmba．j．issn．1673—713X．2014，05．004 · 论 著 · 人谷草转氨酶的基因改造及高效重组表达 王玉梅 ，徐超 ，刘艳，高尚先 【摘要 】 1 材料与方法 目的 构建人谷草转氨酶 (AST)高效重组表达体系。 1．1 主要材料 方法 优化编码人 AST 的核苷酸密码子，合成人 AST新 质粒表达载体 pRSF．Duet、大肠杆菌菌株 BL21 的基因，并将其克隆至 pRSF—Duet表达载体中，转化大肠 为本科室保存 ；限制性 内切酶 BamHI、EcoRI和 杆菌 BL21，以异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导蛋白的表 质粒提取试剂盒购 自宝生物工程 (大连)有限公司； 达，并通过改变诱导剂浓度、振摇速度及诱导温度优化表达 Halt蛋 白酶抑制剂混合物购 自美国赛默飞世尔科 条件，以产生可溶性蛋白。可溶性蛋白经镍离子柱亲和层析 技公司；谷草转氨酶测定试剂盒购 自北京利德曼生 及分子筛层析纯化，以 SDS—PAGE 电泳及蛋白质免疫印迹 化股份公司；镍亲和层析柱购 自上海生工生物工程 鉴定蛋白的性质，对重组蛋白的活性及在血清基质中的稳定 股份有限公司；兔抗人 AST抗体、HRP标记的羊 性进行检测。 抗兔 IgG 抗体为美国 Sigma公司产品；电泳仪、 结果 经过优化的 AST密码子在大肠杆菌中的使用频率 转膜仪、NGC 色谱层析系统为美 国 Bio．Rad公司 均在 10％ 以上；重组蛋白存在于上清和沉淀中，经表达优 产品；ABI9700PCR仪为美国 ABI公司产品；柯 化，在 IPTG 终浓度为 2mmolL／、25℃、150r／min振摇 达凝胶成像系统 4000R 为美国Carestream 公司产 8h诱导条件下，可增加可溶性蛋白的产率，纯化后的目 品；全 自动生化分析仪为 日本 HITACH1日立公司 的蛋 白经 电泳及免疫印迹鉴定为谷草转氨酶，活性可达 产品。 1．2 方法 136000U／L，且在含有蛋白酶抑制剂的血清中稳定存在。 1．2．1 密码子优化与新基因合成 从 NCBI网站 结论 通过密码子优化，成功构建了重组 AST 的高效表达 上检索人 AST的氨基酸序列和基因序列。将检索 系统，重组蛋白可以达到作为参考物质原料的要求。 的基因序列通过 JCat(JavaCodonAdaptationToo1) 【关键词】谷草转氨酶； 重组表达； 基因改造； 密 软件进行大肠杆菌偏爱密码子使用频率分析 ]，并 码子； 参考物质 根据大肠杆菌的偏爱密码子表进行优化，将在大肠 www．cmbpnetCH 中国医药生物技术．20149f5)．341．346 杆菌表达系统中使用频率小于 10％ 的密码子用同 义密码子替换，在保持 AST氨基酸序列不变的前 人谷草转氨酶 (aspartateaminotransferase， 提下，组成新的基因序列；将完成优化的基因序列 AST)广泛分布于人体各组织中，其与谷丙转氨酶