柑桔基因工程位点特异性重组系统研究进展.pdfVIP

24 中 国南 方 果 树 2014年 第43卷 第 6期 柑桔基因工程位点特异性重组系统研究进展 江学友，陈善春 (西南大学柑桔研究所 ／中国农业科学院柑桔研究所，重庆，400712) 摘 要：基于位点特异性重组系统R／Rs和 Cre／loxP的无选择标记基 因转化体系已被成功用于 marker-free转基因柑桔的创制。在柑桔中，IRs系统介导的选择标记基 因的删除往往不精确且 有嵌合体。对于Cre／loxP系统，基于化学诱导系统构建的删除系统能有效清除选择标记基 因，但 同样存在删除不完全的缺点。组成型表达启动子驱动Cre／loxP系统表现出极高的删除效率，且极 少有嵌合体的发生。FLP／FRT系统已被成功用于转基因植物选择标记基 因的删除，但在柑桔上 还没有相关的报道。 关键词：柑桔基因工程；选择标记基因；位点特异性重组系统；基因删除 中图分类号：Q 78 文献标识码：A 文章编号：1007—1431(2014)06—0024—03 柑桔是世界上第一大水果，我国是柑桔生产大 两个 l2bp的反向重复序列和一个 7bp的不对称间 国之一_l1]。转基因技术的成功应用 ，使作物的品种 隔序列组成[]。Ballester等[”首次利用 作正 改良得到了新的突破，但是转基因作物的生物安全 向选择标记基 因，研究了R／Rs系统在柑桔 中删除 性一直以来备受争议 ，最为突出的是选择标记基因 选择标记基因的效率。在该研究中枳橙的上胚轴实 带来的担忧。选择标记基因通常是抗除草剂基因和 生茎段和甜橙的节问茎段被用作转化材料，研究者 抗抗生素基因L2]，其潜在的生态和食用安全风险极 构建了名为 MAT的载体，在该载体 中包含了 由 大_3；此外，即使是对环境无害的、安全的选择标记 NosP启动子启动的 nptⅡ基因盒子，由CaMV35s 基因，用于转化时也不利于多重转化 ，无法将多个优 启动子启动的gus基因盒子，但该基因盒子被两个 良性状累积在同一转化植株内[4]。为解决以上问 同向的Rs序列打断，在两个同向的Rs序列之间构 题 ，人们开发出了标记基因删除技术。目前删除选 建有由CaMVa5s启动子和终止子控制表达的 R／ 择标记基因的方法有转座子系统法、同源重组系统 Rs重组酶基因盒子、由NosP启动子和终止子控制 法和位点特异性重组系统法等_6]。同源重组系统 表达的gfp基因盒子、由ipt自身启动子和终止子 法需要后代异交分离才能得到无选择标记基因的转 控制表达的ipt选择基因盒子，其中R／Rs重组酶基 基因植株[8]，在柑桔这一类多年生、高度杂合的果树 因中插入了一个植物内含子，以防止其在细菌中表 中没有相关的报道，转座子系统法在柑桔这种童期 达。当整个载体导人外植体后，CaMV35s启动子启 很长的植物中也不实用，应用最为广泛的是位点特 动R重组酶基因表达，两个 Rs序列之间的基因片 异性重组系统法。目前应用较多的位点特异性重组 段被删除，其中包括 ipt选择基因。理论上，当删除 系统主要有三类：R／Rs系统、Cre／loxP系统和 事件发生后，位于Rs序列上游的CaMV35s启动子 FLP／FRT系统_g]。笔者就位点特异性重组系统在 将启动gus基 因表达，然而，研究者发现一些 ipt— 柑桔中的研究进展及出现的问题进行综述，以期为 free的转化株 中gus的表达量很低或基本没有表 获得无选择标记基因的转基因柑桔研究提供参考。 达。对 35S-uidA基因设计引物进行的PCR扩增显