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第 12卷第 5期 生 物 加 工 过 程 V0l_12No．5 2014年9月 ChineseJournalofBioprocessEngineering Sep．2014 doi：10．3969／j．issn．1672—3678．2014．05．006 利用蛋 白标签纯化酿酒酵母 RAVE—V1复合物 顾春银，张震宇 (江南大学 生物X-程学院 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122) 摘 要：RAVE(regulatoroftheH 一ATPaseofthevacuolarandendosomalmembranes)是调节液泡ATP酶 (V—ATP酶) 装配与拆卸过程的调节酶，由Ravlp、Rav2p和Skplp3个亚基构成。在酿酒酵母细胞中，当葡萄糖耗尽时，V—ATP 酶分解成V 、V。两部分，此时，RAVE与V。以复合物的形式存在于细胞质中。本研究利用同源重组技术，构建在基 因RAV2的3端定点插入 FLAG标签的重组菌株 BY4742RAV2一FLAG，通过亲和层析原理纯化 RAVE—V复合物， 为后续利用电子显微镜对其进行三维结构研究奠定坚实的基础。结果表明：FLAG标签添加到Rav2p的C端可以 成功纯化出RAVE—V。复合物；结合质谱鉴定首次发现了Leulp与RAVE存在相互作用关系，这使得对RAVE的研 究转向一个全新的方向；此外，本研究方案对其他调节蛋白及与之相互作用的蛋 白组的分离纯化具有借鉴意义。 关键词 ：酿酒酵母 ；V—ATP酶 ；亲和层析 ；同源重组 ；蛋 白标签 中图分类号：Q291 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2014)05—0034—05 PurificationofRAVE-V1complexfrom Saccharomycescerevisiaeviaproteintagging GU Chunyin，ZHANGZhenyu (KeyLaboratoryofIndustfi~BiotechnologyoftheMinistry ofEducation，SchoolofBiotechnology， JiangnanUniversity，Wuxi214122，China) Abstract：Theregulatoroftheproton—translocatingATPasesoftheVacuolarandEndosomalmembranes (RAVE)，isanessentialfactorforthereversibleassemblyofvacuolarproton—translocatingATPases．In yeastcells，when glucose was exhausted，the V—ATPase decomposited into V1 Vo，and the RAVE ， combinedwithVltoofrm thecomplexinthecytoplasm．Byusingtheaffinitychromatography RAVE—V1 ， waspurifiedthrough addingtheFLAG tagsto theC terminalofRav2p which wasusef