共表达口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1-2A基因和蛋白酶3C基因牛肾细胞株的筛选及稳定性.pdfVIP

微生物学报ActaMicrobiologicaSinica 48(11：1520~1525；4November2008 ISSN0001-6·209；CNll-1995／Q http：／j／ournals．im．ac．cn 共表达 口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1．2A基因和 蛋白酶3C基因牛肾细胞株的筛选及稳定性 李炯，刘艳红，刘湘涛，尚佑军，刘俊林，安芳兰，殷宏 (中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，农业部畜禽病毒学重点开放实验室， 国家口蹄疫参考实验室，兰州730046) 摘要：【日的】筛选稳定表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的牛肾细胞 (Madin—Darbybovinekidney，MDBK) 株。【方法】采用聚合酶链式反应 (Polymerasechainreaction，PCR)方法从重组质粒 pMD．P1．2A 和pMD一3C中分别扩增口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1．2A基因和蛋白酶 3c基因，将两基因依次插入 逆转录病毒载体 pBABE—puro。重组逆转录病毒载体 pBABE—puro／P1．2A．3C和 pVSV-G质粒载体用 脂质体介导共转染GP2．293包装细胞。产生的重组逆转录病毒感染MDBK细胞后使用嘌呤霉素筛选 抗性细胞。利用克隆环套取法得到单克隆细胞。经间接免疫荧光和酶联免疫吸附测定 (Enzyme—linked immunosorbentassay，ELISA)方法检测MDBK细胞中衣壳蛋白的表达，并在电镜下观察口蹄疫病毒空衣 壳。【结果】成功筛选到稳定表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的MDBK细胞株，衣壳前体蛋白P1—2A在蛋白酶 3c裂解作用下正确组装成空衣壳。【结论】该研究为口蹄疫亚单位疫苗的研制提供了实验材料。 关键词：逆转录病毒载体 口蹄疫病毒 衣壳蛋白MDBK细胞 中图分类号：$852．65 文献标识码：A 文章编号：0001—6209(2008)11—1520．06 口蹄疫 (Foot—and—mouthdisease，FMD)是猪、 diseasevirus，FMDV)空衣壳由VP0、VP1和VP3各 牛、羊和野生偶蹄动物的一种急性 、烈性传染病…。 60个拷贝组成，其不含病毒核酸，无感染能力。实验 该病传播速度快、感染率高，一旦爆发将给发病国家 表明空衣壳不仅能诱导机体产生免疫反应，而且能诱 和地区的畜牧业和进出口贸易造成巨大损失。疫苗注 导产生与全病毒相似的特异性中和抗体9【l，因此其成 射是控制该病的有效手段。传统的灭活疫苗在 FMD 为疫苗研究的候选抗原之一。逆转录病毒载体具有将 的防控中发挥着主导作用，但其安全性存在一定缺 目的基因高效转染细胞 ，并稳定表达的优点I1…。如能 陷，因此研究更为安全、有效的新型疫苗迫在眉睫。 利用该载体转移 FMDV抗原基因，并筛选到稳定表 近年来基因工程疫苗的研究发展迅速 ，并逐渐成为 达抗原基因的细胞株 ，就能解决疫苗研究中抗原持续 FMD疫苗研究的热点I2曲】。 性获取的问题 ，这必将为成功研制口蹄疫亚单位疫苗 亚单位疫苗是基因工程疫苗的一种，由于其只含 奠定 良好的基础。 有病原体的一部分，不会引起动物发病，安全性很高， 最早 Conet”和 KarlssonI等用逆转录病毒载体 所以成为基因工程疫苗研究的热点之一6『墙】。选择何 实现了人珠蛋白基因的正确表达 ，1990年美国科研 种病毒抗原及如何有效、持续性的获得抗原是疫苗研 人员使用逆转录病毒载体进行了第一例人类基因治疗 究中首要解决的问题。口蹄疫病毒 (Foot—and．mouth 并取得成功n。在兽医领域科研人员已经使用该载体进 基金项目：国家 “863计划”(2006AA10A204)；甘肃省科技攻关项 目(ZGS052．A41—0006一O3)；中国农业科学院兰州兽医研究所所长基金 通讯作者。Tel：+86．931．8342706；Fax：+869·31-8340977；E-mail