长春花文多灵生物合成关键酶D4H同源基因分子生物学研究.pdfVIP

2010全国生物植物学研讨会 基因组与功能基因组 长春花文多灵生物合成关键酶 D4H 同源基因分子生物学研究 周晨，赵淑娟*，胡之璧 中药研究所，上海中医药大学，上海市蔡伦路 1200 号，上海，中国 长春花(Catharanthus roseus (L.) G. Don.)生物碱具有重要的药用价值，其中尤 以长春碱（vinblastine ）和长春新碱（vincristine ）的抗肿瘤活性最令人瞩目[1]。长 春碱和长春新碱由单体长春质碱和文多灵（vindoline ）偶合而成[2]，脱乙酰氧基 文多灵-4-羟化酶（desacetoxyvindoline-4-hydroxylase，D4H EC.1 ）是文多 灵合成的关键酶[3-5]。我们应用抑制性差减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization ，SSH）筛选到长春花激素非依赖型细胞系C20hi 中特异表达的基因 片段[6]，在此基础上，克隆了一个与d4h 高度同源的基因 d4h-like 的全长cDNA 序列（Genbank 登录号 EF640810 ），该基因编码372 个氨基酸，与已报道的 d4h 基因在氨基酸水平具有 66%的一致性和 80%的相似性。半定量RT-PCR 实验结果 表明 d4h-like 基因在长春花根中和 C20hi 细胞株中表达量最高，茎和 C20D 次之， C20 细胞中微量表达，叶片和花中不表达。光诱导实验显示 d4h-like 基因可能不受 光信号的诱导。原核表达系统表达并纯化出 D4H-like 水溶性的重组蛋白。基因组 步行技术克隆了 d4h-like 和 d4h 基因上游 2979bp （Genbank 登录号 GU363550 ） 和 905bp （Genbank 登录号 GU363551 ）的启动子序列。这两个基因的启动子区域 均包含有典型的启动子特征序列：TATA-box 和 CAAT-box，并带有应答光照、茉 莉酸甲酯和真菌诱导子等外界信号以及维管组织特异表达等顺式作用元件。 d4h-like 和 d4h 基因启动子调控 GUS 报告基因的瞬时表达实验结果显示：d4h-like 基因上游的三个不同长度的启动子片段及 d4h 基因启动子序列均能调控 GUS 基因 在长春花细胞中瞬时表达。以上结果表明，d4h-like 可能是 d4h 的同源基因，其在 长春花中的具体功能还有待进一步研究。 关键词:长春花，文多灵，生物碱，D4H ，原核表达，RT-PCR ，启动子，瞬时表达 致谢: 感谢中国科学院植物生理生态研究所何玉科研究员。本研究由国家自然科 学基金（编、教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助。 参考文献: [1]. R van Der Heijden, DI Jacobs, W Snoeijer, et al. （2004 ） The Catharanthus Alkaloids: Pharmacognosy and Biotechnology . Curr Med Chem, 11(5): 607. [2]. T. Endo, A. Goodbody, J. Vukovic, et al. (1988) Enzymes from Catharanthus roseus cell suspension cultures that couple vindoline and catharanthine to form 39,49-anhydrovinblastine. Phytochemistry 27 2147–2149. [3]. E. De Carolis, F. Chan, J. Balsevich, V. De Luca, Isolation and characterization of a 2-oxoglutarate dependent dioxygenase involved in the second-to-last step in vindoline biosynthesis. Plant Physiol 94 (1990) 1323–1329. [4]. E. De Carolis, V. De Luca, Purification, characterization, and kinetic