基因枪介导小麦条锈菌毒性突变地研究.pdfVIP

真菌病害 √基因枪介导小麦条锈菌毒性突变的研究 张如佳，井金学 (西北农林科技大学植物保护学院植物抗病遗传实验室与陕西省 农业分子生物学重点实验室，陕西杨凌712100) 小麦条锈病是由小麦条锈菌(Puccinia tritici)引起的气流传播性病害，是世界各 striiformisWest．Lsp 主要麦区，也是我国小麦上最重要的病害和主要监控研究对象。国内外研究和生产实践证明，种植抗锈良 种是综合控制小麦条锈病最经济、有效、易行和对环境安全的核心措施。但是小麦条锈菌毒性变异频繁， 可以通过变异产生新的毒性小种，导致小麦品种抗病基因失效，引起小麦条锈病周期性流行危害。因此， 阐明小麦条锈病菌毒性变异的原因和规律，是小麦抗病育种，延长小麦品种使用寿命，防治小麦条锈病亟 需解决的关键问题。小麦条锈菌主要是通过突变和异核作用产生致病性变异，构建病原菌突变体库是对其 进行分子遗传分析的基础，也是克隆致病相关基因的捷径。本研究探索了插入突变产生小麦条锈菌突变体 的途径，建立了一套有效的条锈菌遗传转化体系，主要研究结果如下： 1．建立了小麦条锈菌基因枪法转化体系：本研究对影响基因枪轰击转化率的爆裂膜承载压力、射程、 金粉用量、金粉颗粒的大小、小麦条锈菌夏孢子的密度和水化时间以及轰击时的氦气压等多种因子进行了 优化。建立了优化的小麦条锈菌基因枪法转化体系：轰击前将0．2mg夏孢子均匀的涂布于12cm面积的琼 离为0．8cm，阻挡网与靶细胞之间的距离为6cm，氦气压为2．7x104Pa。 2．明确基因枪法转化条锈菌后报告基因的瞬时表达特点，确认GUS基因和潮霉素抗性基因hpt均可 夏孢子中的表达率相对较高可达到0．2％和0．34％，但是转化后的夏孢子萌发率却只有25％左右。同时还 发现经X—Gluc染色后，．有些孢子颜色呈深蓝色，有些孢子则呈浅蓝色，表明在锈菌孢子中GUS基因的拷 都比对照有显著的提高，说明hpt基因已在夏孢子中表达。因此GUS基因和潮霉素抗性基因hpt均可作为 条锈菌转化体的筛选标记。 3．获得了基因枪法转化的条锈菌毒性突变体：以小麦条锈菌白化单孢菌系．5为转化受体，以分别含 ．】9． 中国植物病理学会2007年学术年会论文集 基因表达，随着代数的增加表达量减少，三代后检测不出来。以携带潮霉素抗性基因hpt的质粒pKLHy914 应型由野生菌系的4型变为2、3型，毒性发生分化。采用中国鉴别寄主对突变体的毒性研究表明，各突 变菌株的毒性均较原始菌系发生了明显改变。进一步用hpt基因特异PCR在两个突变菌株中均扩增到目的 片段，初步证明Mllo¨2、M110¨；的突变是由hpt基因插入引起的。 本项目采用基因枪轰击导入外源标记基因，获得条锈菌致病性变异的突变体，建立了条锈菌致病性遗 传研究新的技术体系，为条锈菌毒性基因的克隆和阐明条锈菌毒性变异的机理奠定了基础。