PDGF-B链基因三链形成寡核苷酸对C6胶质瘤细胞增殖与凋亡的影响.pdfVIP

首届中国中青年神经外科医师论坛论文汇编 大会交流 ·355 PDGF-B链基因三链形成寡核苷酸对C6胶质瘤细胞增殖和凋亡的影晌 解放军306医院神经外科(北京11)010I)李维方 周定标 解放军总医院神经外科(北京100853) 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室 余新光 金由辛 胶质瘤是最常见的颅内肿瘤，它的形成和发展与多种生长因子及受体、原癌基因激活和抑癌基因的 失活有关，是一个多因素和多步骤的过程。细胞过度增殖和凋亡抑制是转化细胞的共同特征，二二者平衡 失调导致的细胞异常蓄积是多种肿瘤发生、发展的中心环节，”“ 已知m小板源生长因子(platelet— derived factor growth growth factor，PDGF)B链基因与其受体(platelet—derived 达形成的异常自分泌环与多种人体肿瘤的发生、发展密切相关。”。。 本实验设计了针对PDGI一二B链基因 略和途经。 材料与方法 PDGF，B链基因三链形成寡核苷酸(’lfiplex．forming 海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室金由辛教授惠赠：根据e— AGAGGGAAGAGGAAA TCTCCCIqCT 5．C 3．。A：target(+)-39 AGAGG GGAAA GAAGA 5，TFO是据如上的靶基因序列设计的可与之以氢键结合成反平行三链的寡核苷 酸。该靶基因序列在整个255bp的启动子中占据极为重要位置，它的缺失将引起整个启动子的失活，而 使PDGF．B基因无法表达。 C6胶质瘤细胞培养和实验分组及处理： 培养，待细胞生长到实验所需要的细胞数后，以0．2％胰蛋白酶消化，离心，再次传代，2天后细胞处于生 培养液接种于Nunclon TFO。继续培养48h，收 每组6孔。对照组为6孔。实验I组每孔加入125txg、实验Ⅱ组每孔加入500卜g 集各孔细胞。各管调整细胞数为1×106／ml。各管各取2001d细胞悬液，直接做细胞凋亡检测。其余的 4℃冷无水乙醇中固定，放入4℃冰箱24小时保存后待测。 7001xl PDGF．B链基因哪。对C6胶质瘤细胞PDGF．B链基因、PCNA表达 的细胞悬液分别与工作浓度1：100的二抗(荧光标记的兔抗山羊抗体，购自华美生物公司)、工作浓度1： 100的二抗(荧光标记的兔抗小鼠抗体，购自华美生物公司)50止混合，于室温避光保持60分钟，离心后 洗涤2次，加50(3lm生理盐水混悬细胞。另设阴性对照，仅加二抗，一抗用PBS代替。上流式细胞仪检 测。流式细胞仪做免疫流式细胞检测的实验结果以测定10000个细胞的平均荧光。 首届中国中青年神经外科医师论坛论文汇编 大会交流 PDGF-B链基因TFO诱导c6胶质瘤细胞细胞凋亡 BindingBuffer(Bender 经以上处理的细胞，每管加人30m 50峙／m1)的PI(Sigma公司产品)，室温避光保持15分钟，加生理盐水至lml，上流式细胞仪检测。 统计学分析方法 8．0 计量资料以X±SD表示，使用SPSS 示差异显著，以P0．叭表示差异非常显著。 结果 PDGF-B链基因TFO对G6胶质瘤细胞PDGF-B链基因、PCNA表达的影响 从中可以看出随着PDGF—B链基因、PCNA表