核酸扩增抑制因素的分析与探讨.pdfVIP

核酸扩增抑制因素的分析与探讨 1 2 3.* 任晓峰 ，尹杰超 ，李根喜 1南京大学生命科学学院,江苏，南京（210093） 2 东北农业大学动物医学院,黑龙江,哈尔滨（150030） E-mail （genxili@ or rxfemail@ ） 摘 要： 聚合酶链式反应 （PCR）已经成为生物学研究中一项 常用的技术。 通过 PCR 方法 扩增核甘酸过程中会存在许多抑制因素。这些抑制因素可能以下面三种中的一种或多种方式 发挥作用.一是通过干扰提取 DNA 过程中的细胞裂解；二是妨碍核酸变性或提取；三是抑制 用于靶 DNA 扩增的聚合酶活性。尽管有人已经报道了许多的抑制因素, 但许多机理及其作用 方式仍不清楚。这些影响因素对食品与环境检测，临床实验等方面的研究有很大的影响。本 文就核酸扩增过程中可能的抑制因素进行分析和讨论。 关键词： （PCR， 抑制因素， 分析，探讨） 影响检测水平的因素 培养液检测方法能极精确地对微生物进行定量，这种精确性在临床食品和环境调查中非 常重要。在实际上由于样品误差，敏感性可能降低。细胞在检测区的随机分布可致这一个单 细胞或基因拷贝实际上与理论上计算的数值不一定相符。由于抑制物的广泛存在，临床食品 及环境样品的敏感性均要降低（1）。 一种物质在不同反应体系中有时是抑制物有时是促进物。在不同的稀释浓度的条件下， 同一化合物在同一反应体系中有时是促进物有时是致弱因素 （2）。菌体和非靶 DNA 在不同的 体系中既有阻碍作用有时又无阻碍作用。有时高水平的背景菌 DNA 不能抑制特异性扩增。菌 体在 PCR 过程中也可能有阻碍效果。 非特异细菌的存在抑制了抗原抗体反应，众所周知，脱脂奶能克服这种抑制，作为阻碍 剂，它还能防止细菌对免疫磁性珠的非特异性吸附。在转膜杂交时，可用来阻断非特异性反 应。但奶成分有可能掩盖 DNA，防止其与多聚酶相接触。 反应条件 许多原因均可导致不适宜的反应条件出现。例如不适当的引物，不适宜的时间及温度条 件，不同质量的多聚酶及不适当的镁离子浓度。应该根据计算出的引物熔点尝试几种温度下 的反应方案。来使这些因素合理化（2，3）。同时 PCR 之前所采用的镁离子稀释浓度应取决 于所检测物的敏感性及特异性。热循环仪内温度分布不均可导致扩增效果降低，可以通过加 入甲酰胺来解决该问题 （3）。因为它能降低 DNA 的解链温度，但用该方法处理后反应特异性 有可能降低。在选择热循环仪时，要考虑其优良的热均匀性，这在进行敏感的特异的检测过 程中是十分重要的。同时也应注意循环时间及温度的可重复性，特别是当用一新型机器或使 用具有不同热传导特性的反应管时，应清理样品反应区以保证热均匀分布一致的结果（3）。 采用物理方法进行数据修改如热启动可增加反应产量及特异性。当在有高水平非靶 DNA - 1 - 背景条件下对低拷贝数得分子进行检测时，在温度达到反应变性温度时再加入反应物，则效 果很好。因为此时减少了与靶序列特异扩增相竞争的错配引物反应及引物寡核甘酸 自身环 化。二甲基亚砜 （DMSO）在 RT-PCR 时能提高反应的产出量.对一些病毒靶 RNA 而言，适宜的 DMSO 的浓度促进逆转录酶活性及提高 PCR 效率。主要是通过消除非特异性扩增，改变多聚 酶热活性或通过改变模板的二级结构而增加引物的退火效率起作用。镁离子也是 TAQ 多聚酶 的重要辅助因子，它的浓度将影响着扩增的特异性及成功与否。多种化合物或钙离子对镁离 子的影响作用可能抑制扩增 （4）。总之，通过优化反应条件，并且最大程度减少污染物及已 知的抑制因素来确保反应混合物的成分具有最适当数量，可以最大限度地降低反应抑制作 用。 污染和其他因素 污染和其他一些因素与反应密切相关，甚至一些明显惰性的成分，也能在分子间相互作 用的不同环节中起到抑制作用。现并未完全弄清他们的作用方式