BMI1基因在喉鳞状细胞癌及肿瘤干细胞中与研究.pdf

复旦大学博士论文 中文摘要 BMll基因在喉鳞状细胞癌及肿瘤干细胞中的研究 第一部分人喉鳞状细胞癌中BMTl基因的检测 目的探讨人喉鳞状细胞癌标本中BMll基因的表达情况及BMll基因的表达与 喉癌的临床分期与分型之间的关系。 方法收集人喉鳞状细胞癌肿瘤标本和癌旁组织，免疫荧光染色法定性检测BMll 基因在喉癌标本中的表达情况，Real．timePCR和WesternBlot从分子水平和蛋白 水平定量比较BMll基因在喉癌标本与正常癌旁组织中的表达情况，以及BMII 的表达情况与临床分期与分型之间的关系。 结果取得20例喉鳞状细胞癌标本和20例正常癌旁组织标本。其中1．2期喉癌 标本6例，3．4期标本14例；声门型标本4例，声门上型标本16例。肿瘤组织 进行BMll基因免疫荧光染色观察可见BMll基因普遍表达。Real．timePCR结 果显示BMll在肿瘤标本中的表达明显高于癌旁组织(pO．01)，其中3．4期肿瘤 达的比较不具有显著差异。WesternBlot的结果也与Real．timePCR的结果一致。 结论BMll在喉鳞状细胞癌中显著表达，其表达程度与肿瘤的临床分期有关， 但是与肿瘤的分型无明显关系。 Blot 【关键词】喉鳞状细胞癌；免疫荧光染色；Real．timePCR；Western 中图分类号R739．65 6 复旦大学博士论文 第二部分 BMI 1基因对于人喉癌Hep-2细胞系的作用 细胞系的作用。 方法构建慢病毒载体，shRNA干扰使喉癌Hep．2细胞系的BMll基因表达下调。 并用CCK-8法测定细胞的增殖状态。用有限稀释法将培养在96孔板中的两种细 胞制成单个细胞悬液并培养2周，观察克隆形成能力并与固定测量框比较计算面 V染色，比 较细胞凋亡能力。PI染色后用流式细胞仪比较两种细胞的周期分布情况。两种 la 法测吸光度值并计算抑制率，比较对放疗的耐受性。两种细胞中加入3 g／mL， 6 u pg／mL和12g／mE的顺铂注射液，培养24小时后以CCK一8法比较对化疗的耐 8周后观察成瘤情况，比较两组细胞的致瘤能力。 细胞培养1周后测吸光度值，可见从第三天起RNAi细胞的吸光度明显低于Hep．2 细胞，并且有停止生长趋势。单个Hep．2和RNAi细胞在96孔板中培养2周后 观察并用固定测量框比较面积比，可见RNAi细胞形成细胞球体积显著减小，面 的凋亡能力，FITC．AnnexinV染色后用流式细胞仪分析结果也表明RNAi细胞更 容易发生凋亡(po．01)。PI染色后用流式细胞仪检测两组细胞的周期分布，结 果显示RNAi细胞处于G0／G1期的细胞比例显著增高，S期和G2／M期的比例都 显著降低。经2Gy、40y和8Gy的放疗后RNAi细胞对放疗的抑制性显著增加。 经3u u g／mL，6|lg／mL和12g／mL的顺铂化疗后结果显示随着剂量的增加，RNAi 细胞的抑制率在各个剂量都比Hep一2高。体内成瘤实验结果显示RNAi组形成的 肿瘤体积明显减小，重量减轻(p0．01)。 结论BMll沉默能够抑制Hep．2细胞的增殖能力，促进期凋亡，促使细胞在 G0／G1期聚集，减少对放化疗的耐受性，并且能够抑制体内成瘤能力。 【关键词】RNA干扰；增殖；凋亡；成瘤；耐受性 中图分类号R739．65 7 复旦大学博士论文 第三部分 人喉癌Hep．2细胞系肿瘤干细胞中BMll基因的检测 喉癌干细胞中的表达情况。 方法BMll与CDl33在喉癌标本中进行免疫荧光染色，荧光显微镜和激光共聚 率并进行分选。培养观察分选后的细胞，Real．timePCR定量检测两组细胞中 CDl33的相对表达量，以及干细胞基因Notch2和PTEN的相对表达量。 结果BM