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第二章 新技术在实验诊断中的应用 随着科学技术的不断发展,在原有技术不断得到完善的基础上,新技术也不断涌现并应用的实验诊断中,使实验诊断技术不断提高。 下面就介绍近年来出现的新的实验诊断技术。 第一节 分子诊断技术 一、核酸分子杂交技术(molecular hybridization) 基本原理: 采用标记的核苷酸单链(probe),在一定条件下,按碱基互补配对原则,与互补的核酸单链退火形成单链杂交体,对靶序列进行定性或定量的分析。 (一)固相分子杂交 Southern blot:检测DNA; Northern blot:检测RNA; Dot blot:快速、简便检测DNA或RNA,便于比较同源性; In situ hybridization (ISH):精确分析细胞或组织内DNA/RNA分布及表达情况。 如prob用荧光(fluorescence)标记,称为FISH。 (二)液相分子杂交 核酸酶S1保护分析法(nuclease S1protection assay):准确定量RNA; RNA酶保护分析法(RNase protection assay):同上,灵敏度更高; 引物延伸分析法(primer extension assay):用于RNA5’末端定位及定量; 抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization):检测cDNA。 二、体外基因扩增技术 (一)聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 原理: 利用DNA聚合酶(Taq酶)等在体外条件下催化一对引物间特异DNA片段合成的基因体外扩增技术。引物是指与待扩增DNA片段两翼互补的寡聚核苷酸,其本质是单链DNA片段。当引物与单链模板互补区结合后,在DNA聚合酶作用下即可进行5′→3′合成反应。 PCR技术的基本过程 PCR包括三个基本过程: 变性(denaturation):93~98℃双链解离成单链 退火(annealing): 37~65℃引物结合 延伸(extension): 70~75℃ 碱基互补合成 这三个过程组成一个循环周期;每个周期合成的产物又可作为下一个周期的模板,如此循环往复,经过n轮循环后,靶DNA的拷贝数理论上呈2n增长,亦即一个靶DNA分子经过20轮循环后,理论上,其拷贝数将达百万(220=1 048 576)个分子。 PCR原理示意图 常用PCR技术 RT-PCR (reverse transcription PCR) :检测RNA,如HCV-RNA。 实时荧光定量RT-PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR):适用于多种病原体DNA/RNA的定性及定量分析。 FQ-PCR原理示意图 原位PCR (in-situ PCR):直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增,然后用特异探针进行原位杂交检测含该特异序列的细胞的一种方法。 (二)分支DNA信号扩增技术(branched DNA, bDNA) (三)连接酶链反应(ligase chain reaction, LCR) 自学。 三、DNA序列分析技术(自学) (一)化学降解法 原理 在化学降解法中,单侧末端标记的DNA片段在5组相互独立的化学反应中分别得到部分降解,其中每一组反应特异地针对某一种或某一类被修饰碱基,因此形成5组带有放射性标记的长短不一的DNA混合物。它们的长度取决于该组反应所针对的碱基在原有DNA片段上的位置。然后,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分别分离这5组DNA混合物,再通过放射自显影来检测末端标记DNA链的电泳区带位置。 主要步骤 1、目的DNA的制备; 2、单侧末端标记待测DNA片段; 3、 碱基的特异性修饰及化学降解; 4、聚丙烯酰胺凝胶电泳; 5、阅读分析结果。 化学降解G反应模式图 化学降解反应产物电泳区带放射自显影示意图 (二)末端终止法 原理 在DNA合成反应体系中,除含有正常脱氧核苷三磷酸底物外,还加入少量的双脱氧核苷三磷酸(ddNTPs)特殊底物,由于这种底物的5′-磷酸基团是正常的,能够替代相对应的脱氧核苷三磷酸而与引物延伸链的3′羟基连接,进入部分新合成链;但由于这种特殊底物不存在3′羟基末端,故下一个核苷酸底物不能通过5′-磷酸基团与之形成3′,5′-磷酸二酯键,从而导致DNA新链的延伸提前终止于这一“异常”核苷酸处,而掺入的双脱氧核苷三磷酸则位于DNA延伸链的最末端。 主要步骤 1、单链DNA模板的制备; 2、DNA模板与测序引物退火; 3、掺入法标记反应; 4、延伸-终止反应; 5、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳; 6.、放射自显影; 7、
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