从隐性感染猪中检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体.pdfVIP

184国家星火培训计划及国家农业行业科技：第十一届全国塑蕉!堡猪场主要瘴病监控与净化专题砑过会诠塞煎选 从隐性感染猪中检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体 王贵平1，胡仕凤1，蒋芬芳2，李晓云1，余兴龙’，杨兴东1 (1湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128，2长沙县畜牧水产局，湖南长沙410000) 摘要l用16S 猪鼻支原体检测，结果发现猪肺炎支原体检出率是：鼻拭子096、气管拭子14．8％、支气管肺泡灌洗液74．6％、 探明了猪肺炎支原体和猪鼻支原体在隐性感染屠宰猪呼吸道的分布特点。首次对我国猪鼻支原体流行病学 进行了调查。 关键词。猪肺炎支原体和猪鼻支原体；检测 前言 长速度下降和饲料报酬降低等。Mhp和其他病原微生物一起引起的猪呼吸道疾病综合症，已成为我国养猪 业疫病防制中十分突出和十分棘手的问题。猪鼻支原体(Mycopiasma 继发菌，可以引起猪的肺炎、关节炎和浆膜炎。检测猪支原体感染可以为防控猪喘气病提供依据。由于分 离鉴定非常困难，猪支原体的检测常用其他技术特别是PCR技术来代替。有关猪喘气病的流行病学资料已 经比较丰富，但是大多数是在已经出现明显的临床症状或临床病理变化情况下取得的。而猪支原体在隐性 感染率和在猪呼吸道的分布情况却知之甚少。本文调查了湖南省猪肺炎支原体和猪鼻支原体的隐性感染率 和在猪呼吸道内的分布，为防控猪喘气病提供了有力的依据。 1材料与方法 1．1猪群 疫苗，临场检测仅一头出现呼吸道症状(咳嗽等)。有三头猪出现肺部病变(病变区域至10％)，但其中仅 一头出现典型猪喘气病病变(虾肉样病变)。 1．2样品 从每头猪5个样品位点按下列顺序收集样品：血清、鼻拭子、气管拭子、支气管肺泡灌洗液和肺。从 屠宰放出的颈血中收集血液。从猪气管和支气管交界处剪开。用无菌的棉签在鼻腔和气管内反复擦拭三次 国家星火培训计划及国家农业行业科技：第十一届全国规模化獾场圭要疫病监控与净化专题研讨金硷文摘选 185 后放入运输缓冲液(KM：液体培养基，购自江苏省农科院)中，即形成鼻拭子和气管拭子样品。将50ml无 7．8)灌入支气管中，向肺泡方向尽力挤压静止1分钟，然后上下倒置颠倒三次后回 菌的PBS(0．1M，pH 收液体(10-30m1)，即为支气管灌洗液。从肺组织病变和非病变交界处收获肺组织样品。所有获取的样品 立即放入无菌的Eppendorf管或无菌的离一tX,管中，立即送实验室检测或一20。C冻存备用。 1．3 P僳检测 1．3．1引物 按出版文献的相关序列，由上海生工生物工程有限公司合成(表1) 表1P僳引物 退火 目标基因名称 引物 序列 产物(bp) 温度 上游引物 5’一GAGCCTTCAAGCTTCACC从GA一360℃ 649 6SrRNA $4hpl CACC-3’ 下游引物 5’一TGTGTTAGTGACTTTTGc 上游引物 5’一GGI∞CGATGA从CCTATTAAAATAGCT-3’50℃ 948 P36 Mhp 下游引物 ‘ 5’—GcCGCG从ATTAAATATTTTTAATTGCATCCTG一3’ 上游引物 5’-GTAGTC从Gc从GAGGATGT-3’ 50℃ 346 梅rP37 下游引物 5’—GCTGGAGTTATTATACCAGGA-3’ 1．3．2模板制备 样品中棉棒然后弃去棉棒。从肺组织样品中取0．259，用2ml无菌的PBS匀浆后用两层纱布过滤。 1．3．2．2 pl上清液做为模板DNA。 1．3．3PCR u buffer