甘草素(liquiritigenin)抑制裸鼠人宫颈癌HeLa细胞移植瘤生长与血管生成作用的研究.pdfVIP

甘草素 （liquiritigenin）抑制裸鼠人宫颈癌HeLa细胞移植瘤生长及血管 生成作用的研究 刘雨欣 谢思柔 王杨 罗康 王宇 蔡云清 南京医科大学营养与食品卫生学系 摘要：目的：建立裸鼠人宫颈癌HeLa细胞皮下移植瘤模型，探讨甘草素是否具有抑制 裸鼠人宫颈癌HeLa细胞移植瘤血管生成作用，并初步研究其对血管生成相关靶向因子 的调节作用。方法：本研究经体外培养HeLa细胞，建立裸鼠人宫颈癌HeLa细胞皮下移 植瘤模型。随机将裸鼠分为4组，每天经口给药，四周后处死。应用免疫组织化学的方 法检测人宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤中CD31、SMA的表达水平。应用免疫组织化学的 方法、ELISA方法、Westernblot方法检测荷瘤裸鼠VEGF、TSP-1蛋白表达水平。结 果：甘草素组裸鼠的瘤重和瘤体积与对照组相比均有降低，并呈剂量依赖效应。免疫组 化显示，随甘草素剂量增加CD31、SMA、VEGF表达均逐渐下降，而TSP-1蛋白表达无明 显变化。ELISA方法和Westernblot方法检测VEGF/TSP-1表达水平，甘草素组与对照 组相比VEGF表达下调，呈剂量依赖效应，TSP-1表达无明显变化。结论：甘草素能够抑 制裸鼠人宫颈癌HeLa细胞皮下移植瘤的生长并可抑制移植瘤的血管生长作用，其作用 机制可能与甘草素抑制血管生成相关因子VEGF的表达有关。 关键词：甘草素；裸鼠；宫颈癌HeLa细胞皮下移植瘤;CD31;SMA;VEGF 影响线粒体跨膜电位极化，改变线粒体膜通透性，促使细胞色素C释放，进而引起 能明显抑制荷瘤小鼠H盐移植瘤的生长乜驯。近期实验室研究又表明，在体外试验中，甘草 素能通过抑制删P一2的表达来抑制人肺腺癌A549细胞的迁移能力，同时甘草素降低人宫 管腔形成，从而抑制肿瘤血管新生作用¨“扣3。然而其在体内是否同样具有抑制肿瘤生长 和血管新生的作用尚无研究。 1、材料与方法 1．1、材料 甘草素购自南京中医药大学中医药研究院，纯度为99．68％。DMEM培养液、胎牛血 bovine 清(fetal serum，FBS)、胰蛋白酶购自Gibco公司；纤维素钠由江苏省医药农 药兽药安全性评价与研究中心惠赠。人宫颈癌HeLa细胞株由南京医科大学公共卫生学院 分子毒理学实验室馈赠，购自上海生命科学研究院细胞所。五周龄BALB／c裸鼠及其饲料 抗PCNA购自美国Santa Cruz公司。 试剂盒北京中杉金桥公司。兔抗CD3l、SMA、VEGF及TSP一1购自美国Santa 1．2．方法 1．2．1细胞培养 1×105 U／L青霉素和100 mg／L链霉素的DMEM培养液中。待细胞贴壁生长长满至80％左右 单层时，用0．25％胰蛋白酶溶液进行消化、传代，取生长良好的细胞进行实验。 1．2．2实验动物的饲养和模型的建立 本研究中共有32只裸鼠，所有实验裸鼠均由南京医科大学SPF级动物实验中心饲 养。裸鼠可自由采食和饮水。垫料、饲料以及饮用水均经高压处理，定期用紫外线对环 境消毒。适应性喂养7天后，建立裸鼠移植瘤模型：取处于对数生长期的HeLa细胞， 0．25％胰蛋白酶消化后用无血清培养液离心洗涤2次，并用无血清培养液调整细胞浓度 ％酒精消毒的裸鼠右侧腋窝皮下。接种时局部出现明显皮丘，3天后32只被接种裸鼠皮 下均出现结节，裸鼠移植瘤模型建立。 1．2．3动物的分组及处理 在裸鼠皮下结节出现的第三天开始给药。将裸鼠随机分为4组，每组8只，每笼4只裸 234 鼠。对照组给0．5％的羧甲基纤维素钠溶剂灌胃给药，甘草素每天配制，溶于O．5％的羧甲 4天测量荷瘤小裸鼠肿瘤大小，以游标卡尺测量裸鼠肿瘤的短径、长径，按公式计算瘤 质量(肿瘤抑制率(％)=(阴性对照组平均瘤重一用药组平均瘤重)／阴性对照组平均瘤重 ×100％)，切取一部分肿瘤组织标本放于10％甲醛中固定，用于免疫组化和病理观察。 一部分肿瘤组织标本放置入经处理后的冻存管，放入液氮内保存。 1．2．4免疫组化染色 取一部分肿瘤组织经甲醛固定、石蜡包埋后切片，采用SP法染色，操作步骤按试剂 盒说明进行，滴加CD31、SMA、单抗，以PBS代替一抗作阴性对照，以己知阳性的切片作阳 性对照。微血管