RGD功能化微流控细胞培养芯片研究.pdfVIP

微流控芯片实验室进展 RGD功能化微流控细胞培养芯片的研究 毕颖楠1张惠静件管潇1邓金1 1第三军医大学医学检验系分析化学教研室，重庆400038 生物功能化是近年来微流控芯片技术中新兴的研究热点，由于借助了分子间的特异性识 别，一方面能够增加芯片的对靶细胞的特异性和敏感性来捕捉、筛选靶细胞【l捌；另一方面， 通过生物化修饰，可提高芯片的生物相容性，利于细胞的生存培养【3J，同时芯片的构造也相 对简单。目前多数研究均是将大分子蛋白质固定于微通道表面，以完成生物功能化修饰，但 由于蛋白质分子属于大分子类生物活性物质，其有效的生物学活性依赖于自身的空间结构， 在固定中蛋白质的空间活性位点一旦被遮蔽或破坏，就会降低反应的敏感性和特异性。因此， 为了避免选用蛋白质进行功能化修饰时存在的问题，在本研究中，选用了纤粘连蛋白 面所表达的integrin家族的特异性识别，将RGD固定于微通道表面以实现生物功能化，通 过构建一种无坝型结构、构造简单的芯片系统实现对靶细胞的有效培养。 一、材料与仪器 1．主要试剂和设备 2％3—氨丙基三乙氧基硅烷溶液(APTES：Acetone=l：49，v：v)；碳二亚胺盐酸盐 (EDC)；N．烃基磺基琥珀酰亚胺(NHS)；0．1mol／L 510 5 长)；激光共聚焦显微镜(LSMMETA，ZEISS)；LSMImage软件(ZEISS)。 二、实验方法 1．微通道的RGD功能化修饰 将2％APTES溶液以虹吸作用直接加入已氧化准备的芯片微通道中，使其硅烷化。之 RGD固定于微通道表面以完成功能化修饰，用无菌 后，在EDC和NHS的作用将O．1mg／ml 水冲洗，负压抽干，备用。用激光共聚焦显微镜沿Z轴扫描并成像，分析研究RGD肽的固 5 定效果。用LSMImage软件对扫描结果进行3一D重建，考察RGD肽在微通道表面的固 定结合状况。 2．细胞在芯片微通道内的培养 本研究选用重力引起的压力驱动作为液流的驱动方式：将芯片一端抬高，与水平面夹角 1640培 约为50，液流在重力的作用下由高端流向低端，液流速度约为1．21xl／min。将RPMI 养基以虹吸作用加入芯片中，使微通道及储液池内充满培养基。把储液池R2处的培养基吸 干，加入制备好的10S／ml A549细胞悬液(15“1)，以重力作用注入微通道，为避免培养基蒸 发，将进样后芯片放入湿盒，以无C02常温条件对细胞进行培养。储液池中的培养基，每2 个小时更换一次，以保证通道内细胞有足够的养料能够生存。 3．细胞的活性研究 细胞进行标记以及活性测定，在激光共聚焦显微镜下对其进行观察。 三、结果与讨论 510 对FITC．RGD肽固定后的微通道进行扫描成像(LSMMETA，ZEISS)，结果如图l 所示，与空白对照相比，评价RGD生物功能化的效果。扫描结果提示，采用化学键联接的 方式可有效地将RGD固定在微通道表面。用激光共聚焦显微镜对FITC—RGD固定后的微 通道进行逐层扫描，所得图像经LSM5Image软件3一D重建，以评价经此方法固定后RGD CB 通讯联系人；张惠静zhanghuijing缸ail．t_叫．COaL ．刖；心用 在通逆表面的分布情况。结果如蹦2所示，由此削可见，RGD肽在儆通道管晕。t分布均匀 一致。 [[ 401“咖1肼oⅢ《[HmⅫ匿B艄w蛳 目2F1w一釉lj^“瘟定自∞徽自逋白勺3一D重《 目l“Tc一釉同定∞m＆m 在培养韧始4h时，用FITC—RGD对细胞进行标记，结果显示，形态良女f(圈3，A)； 细胞在微通道中生存12小时后仍其有完格结构．此时细胞在微通道内的墩向有一定规则， 与流体流动方向平行(蹦3)，B细胞的排列取向与流体的排列方向一致