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线粒体基因组在初治和复发卵巢癌中的变化 史宏晖，潘凌亚，杨秀玉，原野，于晓丹，李京湘 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科100730，军事医学科学院 细胞生物学研究室华大中生生物科技有限公司 近年的研究表明，线粒体除在细胞能量代谢中发挥重要作用外、在活性氧颗粒(ROS)产生和凋亡过程中亦扮演重要角 关注的是线粒体基因在肿瘤组织中的改变。虽然有关肿瘤组织中线粒体DNA突变的报道逐年增加，但这些突变的发生、在肿 瘤发展、化疗耐药和疾病进展中的作用尚未阐明。由于线粒体在能量代谢、ROS产生和凋亡调节方耐具有特殊作用，因此推 应，引起化疗耐药。 突变率比nDNA高10～100倍，推测化疗药物能够导致其突变。由此提出以下问题：肿瘤细胞中检测到的突变是肿瘤发展过 程中形成的，还是化疗药物造成的’经过化疗的耐药肿瘤细胞mtDNA的突变是否更频繁‘7目前国际上仅有个别血液系统肿 瘤的研究资料，在实体瘤未见相关报道。 本研究拟研究mtDNA在初治和耐药卵巢癌组织中的变化，探讨线粒体基因组与卵巢癌耐药的关系。 实验材料 实验对象： 常组织各7例。同期经若下疗程化疗复发的耐药卵巢癌患者的肿瘤组织技其周围的正常组织各9例。 主要仪器及试剂盒 国)。 患者临床资料见表I。 实验方法 1总DNA的提取：按DNA提取试剂盒说明书进行(略)。 2线粒体DNA测序 1)PCR引物的设计及合成 左右)，引物Tm值(60度上下)，GC含量(50％左右)，最大错配限制，发央长度，等等，可得到一系列引物对如F： 扩增引物： 测序引物：42条(略) 以上引物由华大中生生物科技发展有限公司合成。 2)PCR反应体系： 0一，缓冲液2 卜游及下游引物各1Ixl，DNAl山，酶041xl，DNTP2 5斗l，加水至体系容量达25斗l 3)PCR产物琼脂糖凝胶电泳： 用10％的琼脂糖凝胶，200V电压进行电泳约id,sq。 调整退火温度梯度(55℃、60。C、66℃)，对其重新进行PCR和电泳，记录最佳条件。 4)大规模PCR反应 模板DNA分装于96孔板中(I山)，对以上引物进行相同反应体系和最佳热循环条件的PCR。 5)PCR产物纯化：按PCR产物纯化试剂盒说明书进行。 6)测序反应： 反应体系：引物1bcl，DNA21,zl，缓冲液2l,zl，BD混合物21zl，加水至体系容积101,zl。 以上体系96(2预变性2分钟，96℃变性10—15秒；55。C退火10秒；60℃延伸4分种；35个循环。 反应后产物用70％乙醇纯化。 7)测序 经洗板、铺胶和清洗后进行大规模测序。电泳后利用DNAstm50对测序片段进行序列拼接，得到所测样本和线粒体基 冈组全长序列进行数据分析：在基因库中(,,qww org)检索线粒体基因组全长序列，将所测初治标本和复发标本的肿 mitornap 瘤组织与正常组织数据与之对比，确定多态性位点和突变位点。 结果 共发现69个基因库未记载的新的多态性变化和17个突变．见表2和表3。 在每个初治样本中检测到的基因库未记载的多态性变化0—5个，平均2 7个，而复发标本是1—10个，平均5，6个。两 组间有显著差异= 初治组和复发组多态数量的比较 两组存在统计学差异。 非编码区的碱基变化不能引起氮基酸和蛋白质的变化，但通过凋控基因的转录和复制影响线粒津的功能，而编码区的碱 基变化可能直接改变氨基酸和蛋白质的结构和功能，进而影响线粒体的功能。初治标本中非编码区，包括D-LOOP区的碱基 9个碱基仃 (C／T)CCCCCC。 初治标本中编码蛋白的碱基改变14个，其中11个编码相同的氨基酸，仅3个引起了氨基酸的改变。复发标本中编码蛋 白的碱基改变41个，其中28个编码相同的氨基酸，13个引起了氨基酸的改变。 图1标本B2位点5239处的变化 图2标本A4位点303-310处的变化