RNA干涉及其应用.pptVIP

2006 Nobel Prize生理学（医学奖) 基因治疗方面的应用 抗肿瘤策略—— 应用RNAi技术抑制肿瘤细胞（如肝癌细胞、胆管癌细胞等）中血管生长因子如血管生成素如angi1、angi2、angi3及VEGF等或其受体的表达，以及抑制肿瘤细胞中如癌基因bcl2、RAS、Tp53等突变基因及其蛋白的表达而不影响非突变基因的表达，可达到很好的抗肿瘤生长及抗肿瘤转移的目的。 抗器官移植排斥反应 —— 细胞间粘附分子-1（ICAM-1）是重要的介导细胞粘附和T细胞激活的分子，应用与ICAM-1基因序列特异的siRNA阻断 ICAM-1 mRNA和蛋白的表达，可以明显降低大鼠同种移植心的移植物血管病的发生的程度和缺血再灌注损伤。 抗病毒策略： 最早用于HIV研究，被Science评为2002年年度突破。 斯坦福医学院的研究群，把dsRNA放进小老鼠的肝细胞，dsRNA被小老鼠体內的核酸酶分解成许多siRNA。研究发现siRNA具有高度专一性，会与小老鼠体內的丙型肝炎病毒的mRNA相结合，使mRNA分解并失去转译蛋白质的功能。斯坦福医学院运用此技术来治疗丙型肝炎的研究，已从体外试管实验阶段推进至体內的动物实验。且在小老鼠身上，看到丙型肝炎病毒被阻断的明显效果。 2004年，美国FDA批准经过修饰的第一个RNAi药物Bevasiranib 进行临床新药试验，用于治疗与年龄相关的黄斑退行性改变。 RNAi临床治疗的前景有赖于 疾病的发生发展与特定基因的关系研究 利用siRNA治疗疾病需要解决几个问题： （1）导入问题，使用高效载体传递siRNA； （2）和给药方式，因为RNA容易被降解，如何提高siRNA在体内的稳定性； （3）高选择性。如何靶向特定细胞而不影响其他细胞。 RNAi实例：Target gene：c-myc 查找靶基因mRNA 利用网络在线支持，寻找siRNA序列 根据目的选择实现RNAi的策略：推荐载体法。 根据查找的siRNA序列，合成长链oligo 构建载体 转染 检测效应（包括干扰效应和生物学效应） 2、/  3、 or 寻找siRNA序列 利用生物学软件组配长链 oligo，（合成单链DNA（直接带有4个bp的酶切位点粘性末端)；载体构建： dsDNA形成：annealing 载体的酶切和回收 连接 转化 鉴定转染：瓶颈之一 含有真核细胞筛选标志 含有荧光标志效应检测：mRNA水平和蛋白水平兼顾 谢 谢！ 商品化载体的siRNA策略示意图 载体介导的细胞内表达siRNA 方法的特点 1、操作简便，稳定性好; 2、siRNA表达载体一旦构建成功，可以无限制的应用于研究; 3、可能建立可以调节表达的系统; 4、受转染等因素的影响比较大。 适用于长期的对于某个基因的研究，尤其是带有筛选标记的载体，能够用于构建特定基因缺陷（knockdown）的细胞株 五、siRNA Expression Cassettes (SECs)方法 快速、不需要克隆测序等步骤 适用于筛选多个候选靶点序列的抑制效率 1、检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对） 目的基因mRNA获取： /ssl-bin/app/rnai 支持accession number 或者序列直接输入 参数设计全面 输出经过筛选的candidate target （BLAST） 推荐★★★★★ /techlib/misc/siRNA_finder.html 最全面的RNA实验相关网站 有商品化的各类载体 获得siRNA target 需要手工BLAST 输出直接可递交公司合成的长链oligo 推荐 ★★★★ * * RNA i 及其应用实例 RNA interference “沉默”是金 后基因组研究焦点：基因功能研究 抑制基因表达 观察功能变化 Knock Out 法 Antisense法 Ribozyme法 RNAi法 概 念： RNA interference（RNAi） 与靶基因序列同源的双链RNA所诱导一种序列特异性的转录后基因沉默现象。 RNAi 发现历程： 1990年，曾有科学家给矮牵牛花插入一种催生红色素的基因，希望能够让花朵更鲜艳。但意想不到的事发生了：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色