13腺病毒载体在肿瘤治疗中的应用.pptVIP

条件增殖腺病毒在肿瘤治疗中的策略 微生物教研室　李晓霞 　 内　容 基因治疗 分类 主要病毒载体系统 腺病毒载体在肿瘤治疗中的策略 条件增殖腺病毒 现状及策略 基因治疗分类 基因治疗分类 离体基因治疗 ex vivo—将目的基因在体外导入自体或异体来源的肿瘤细胞或其它细胞，再将这些修饰过的靶细胞转入体内。 原位基因治疗 in situ—将目的基因载体直接注射或导入体内的肿瘤组织，进行局部治疗，这也是最主要的方法。 体内基因治疗 in vivo—将目的基因载体注射到血液系统进行全身治疗。 基因治疗分类 根据基因导入的方法 裸露DNA直接注射－注射gene gun 脂质体共转化－体外细胞转化 受体介导的基因导入－病毒载体 常用的病毒载体的特点 腺病毒 腺病毒 壳体含有三种主要的蛋白：六邻体（II），五邻体基底（III）和纤突（IV），还有多种其他的辅助蛋白VI，VIII，IX，IIIa和Iva2 腺病毒 线性双链DNA,基因组36kb 早期和后期转录单元 前者有E1a、E1b、E2、E3、E4和两个延迟型早期单元Ⅸ和Ⅳa2，编码病毒的调节蛋白 后者有L1、L2、L3、L4、L5 五个区，编码病毒的结构蛋白 腺病毒载体构建 在人腺病毒C亚群的Ad2 和Ad5 基础上构建 E1区为病毒复制必需区，缺失则成为复制缺陷型载体 E3区是病毒复制非必需区，用于外源基因的插入 腺病毒载体的优点 ①腺病毒粒子相对稳定,病毒基因组重排频率低,外源基因片段插入片段在病毒复制几个周期后仍可保持不变,易于用重组DNA技术操作; ②安全性较好,腺病毒无需整合进宿主细胞基因组中,目的基因在宿主细胞基因组外游离状态下表达,整合突变致癌可能性小,基因毒性低; ③腺病毒基因组较大(36 kb) ,绝大多数基因组(约35 kb)均能被外源基因取代,插入大片段外源性基因的潜力大; ④有较大的宿主范围,可以感染肝细胞、血管内皮细胞等多种人体细胞,对于受体细胞是否处于分裂期要求不严格; ⑤腺病毒载体容易将外源基因直接转移到靶细胞中,并有效表达成活性蛋白。 第一代腺病毒载体 去除了El/E3基因表达盒,可以插入长达615kb的外源DNA。去除E1区还阻止了依赖E1区和E2区功能蛋白的转录与随后病毒DNA的复制及病毒外壳蛋白的产生。E1区缺失的腺病毒在能够反式提供E1区基因蛋白的细胞中得到增殖。 第二代腺病毒载体 在E1、E3缺失的基础上进一步去除了E2区和(或) E4区,减弱病毒蛋白的表达 用于鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症的I期临床实验。 第三代腺病毒载体 通过对无感染能力的腺病毒颗粒的观察,发现无感染能力腺病毒颗粒的基因组都含有腺病毒基因组左端的一段序列即包装信号。因此设想保留两端TR ( Terminal Repeats)及包装信号共约500bp 的顺式作用元件,去除腺病毒基因组中全部编码序列(反式作用元件) ,其它功能由辅助病毒提供,这样的腺病毒载体就是第三代腺病毒载体即所谓空壳载体（gutless adenovirus）。 条件增殖腺病毒 通过基因工程的方法使病毒特异性地在肿瘤细胞中复制来杀死并裂解肿瘤细胞，从中释放出来的病毒又可以进一步感染周围的肿瘤细胞，这类病毒被称为条件增殖腺病毒（conditionally replicative adenovirus , CRADs）或溶瘤腺病毒（Oncolytic adenovirus）。 CRADs 的分类 改变病毒的基因使其可以在肿瘤细胞中复制，而在正常细胞中复制能力降低，称为I型CRADs。 E1B基因 dl1520 (美国ONYX公司)－5型腺病毒，缺失了E1B区编码55kd蛋白的序列，该蛋白可通过结合细胞内的p53使其功能受到阻滞。 头颈部肿瘤和卵巢癌的治疗进入一期和二期临床试验。 E1A 基因 与细胞周期调控蛋白Rb 结合，克服其对细胞周期的抑制作用，使细胞周期由G1 期过渡到S 期，病毒大量复制 腺病毒突变株Ad5-Δ24 和dl922-947的E1A 基因在第2 个保守区（CR2）缺失24个碱基， 利用肿瘤特异性启动子（tumor specific promoter, TSP）控制病毒复制相关基因在肿瘤细胞中选择性表达，称为Ⅱ型CRAD。 这类病毒利用肿瘤特异性启动子，使其控制腺病毒复制必需基因（E1A及E1B），使这些必需基因只在肿瘤细胞中表达，而在正常细胞中不表达，从而实现肿瘤特异性增殖目的。 表２ Ⅱ 型CRAd中的TSP 双启动子 分别调控病毒复制所必需的不同基因。以PSA启动子调控Ad5的E1A，以hK2（human kallikrein 2）的启动子来调控E1B的表达，实现对前列腺癌的双重调控 杂合启动子 由hTERT启动子和CMV最小启动子组成的杂合启动子