数据处理流程 - BGI.ppt

文库质控问题3：文库随机性 GC含量偏差： 实验技术（打断、PCR、测序）本身特点，导致高GC和低GC区域测序覆盖度偏低，甚至某些区域覆盖不到； PCR-free建库技术可减少PCR带来的随机性问题 duplication PCR扩增出很多一模一样的母版分子，测序结果中很多条reads是一样的； 基因组自身重复序列含量高导致duplication偏高； 数据量越大，duplication比例越高 文库质控问题4：其它物种、样品污染 测序质控问题 raw Cluster密度 正常raw Cluster密度： 20~30万/GAtile，200~350万/HiSeqtile Cluster制备时，控制文库浓度，达到适当的raw Cluster密度 密度过低————产量低；密度过高————质量差 样品差异：200小片段能够容忍的密度较高，800bp片段以及RNA样品、特殊样品，应适当降低密度 通过默认质量筛选标准比例(PF) 用read1前25cycle的信噪比进行筛选； 正常PF比例：DNA >80%，RNA >70%； raw Cluster密度越高，PF比例越低； 当raw Cluster密度超高时，图像分析识别出的raw Cluster数量小于真实值，此时PF比例会低于正常； 测序质控问题 光强度信号 受到环境温度、测序仪温度控制、测序仪聚焦、CS试剂、测序试剂、样品等因素共同影响； 测序长度越长，光强度降低越多； 碱基含量不均匀的样品，光强度会有波动，但属于正常 碱基含量 样品本身 测序问题导致有偏向性的测序错误 质量值 Q20：质量值大于等于20的碱基数量/所有碱基数量 reads尾部质量低 Error-rate 与参考序列比较，能够map的reads中： 错误的碱基数量/(正确的+错误的碱基总数)； 与参考序列质量有关； 人、小片段文库：101PE 1%~2% 环化大片段error-rate高于小片段文库 reads尾部error-rate高 正常光强度、碱基含量、质量值、Error-rate 异常光强度、碱基含量、质量值、Error-rate 异常光强度与碱基含量 数据处理流程 计算机集群 测序控制PC 测序仪 1.控制测序过程 决定测序长度、填加试剂、控制温度、控制反应时间、拍照 2.图像分析 对测序仪拍照的图片进行图像分析，得到亮点的光强度和坐标 3.basecalling 由光强度得到碱基序列 4.数据传输 将basecalling结果（二进制文件bcl）传输到计算机集群的存储上 5.数据处理 将bcl文件转化为后续信息分析所使用的文本文件（fastq,qseq） 6.index拆分 7.数据质量分析 8.数据备份 9.后续信息分析...... 图像分析及basecalling基本原理 1 2 3 4 C C C C G G G T T A A A Cycle1 Cycle2 Cycle3 对A发出的光拍照 对C发出的光拍照 对G发出的光拍照 对T发出的光拍照 图像分析及basecalling基本原理 1 2 3 4 T C C A A T G C A C G G Cycle1 Cycle2 Cycle3 由4个cluster得到4条序列： ① ATA... ② CCT... ③ GCG... ④ GAC... 图像分析 对每个图片独立的处理 图像锐化 对图片进行快速傅里叶变换(FFT)，在傅里叶空间乘以滤波函数后反变换 识别cluster/亮点 信噪比(亮度/背景值)大于阈值的亮点区域 计算亮点光强度和位置坐标 在亮点区域，对光强度进行二维插值，求出最大光强度，以及最大光强度对应的位置坐标 将同一个tile的所有图片中的亮点坐标对齐重叠 不同图片之间存在偏移/拉伸/压缩(offset) 系统、稳定的： 4种光折射率不同、滤波片不同、光路不同，所以造成成像的偏移/拉伸/压缩，可利用crosstalk，计算出偏移/拉伸/压缩的数值(offset参数) 偶然、随机的： flowcell表面不平、自动调整焦距、机械移动不够精确、随机振动，可利用crosstalk解决 Crosstalk AC光谱间有交叠，GT光谱间有交叠，所以： 　　　碱基A的图片中包含C发出的光 　　　碱基C的图片中包含A发出的光 　　　碱基T的图片中包含G发出的光 不利：不能直接比较光强度大小而得到碱基 有利：利用图片中共同的亮点，将所有图片对齐重叠，解决offset问题 A C A C 光谱 光谱 滤波片 图像分析流程 Template Generation 利用AC之间的crosstalk、GT之间的crosstalk，将前