海洋微生物Aeromonas+caviae+CB101中几丁质酶表达的调控研究和工业化生产菌株的定向筛选.pdfVIP

福建疆n’ 第三届海洋生物高技术论坛 2005．08．19-23 caviae 海洋微生物AeromonasCBl01中几丁质酶表达的调控 研究与工业化生产菌株的定向筛选+ 李强 肖湘王风平4 国家海洋局第三海洋研究所海洋生物遗传资源重点实验室，福建厦门，361005 caviaeCBl01能分泌至少四种几丁质酶和三种几丁结合蛋白，这 摘要：海洋微生物Aeromonas 一几丁质酶系必须共同作用才能高效降解胶体几丁质。该酶系能被胶体几丁质、几丁寡糖诱导， 但被几丁单糖和葡萄糖所抑制。采用转座子突变技术，我们获得了一系列几丁质酶系组成型表 达突变子、几丁质酶系高表达突变子和几丁二糖酶基因缺失突变子，对上述突变子的发酵情况 进行了研究。进一步对插入突变子插入位点的序列进行分析，找到了诱导几丁质酶系双倍、组 成型表达的基因位点，通过对上述位点的定点诱变，可望大幅度提高几丁质酶系的产率。 关键词：几丁质酶系、诱导、转座子，产率 几丁质(Chitin)，俗称甲壳质，在自然界中含最仪次于纤维素，也是海洋中含帚居首位的 多糖。它是由Ⅳ-乙酰葡萄糖胺单体以13-1，4一糖：曲：键连接起来的离链多聚物，广泛存在j)-蠕虫 类、软体、节肢动物的外壳及真菌的细胞壁中…。目前已确定出3种以氢键相连的天然结晶形 态【2】：含晕最大的c【一几丁质，由两条反向平行链组成，多氢键相连，浸水不胀；D．几丁质，由 两条同向平行链构成，分子链问的氢键较u一几丁质少的多，遇水会膨胀；丫一几丁质，为三条链， 两条J司向，一条反向，类似于0【一和B一几丁质I’内混品。几丁质由于分子内氢键较强，所以稳定性 强、溶解性能差(不溶_：水，稀酸、稀碱和一般有机溶剂)。几丁质若脱乙酰化即成壳聚糖 (chitosan)，是啤洒酵母的子囊孢子外壳、毛霉细胞擘的主要成分【3】。壳聚糖的溶解性大为改善， 虽不能直接溶，J：水但却能溶1：酸或酸性水溶液中。几丁质分子中还存在一些游离的氨基基团， 借此碱性基幽与其它离子基团结合成共价或1卜共价化合物，所以在天然状态下，几丁质通常与 蛋ig质、脂类、B一葡萄糖胺相交联』f：发生不同程度的矿化(特别是钙化)【3J。几丁质及其衍生物 在食品、医药、化工、生物、农业、纺织、印染、造纸、环保等众多领域中均具有极其重要的 用途‘41。 海洋环境下，绌菌对几丁质的降解至少分为四个阶段：(1)经随机分裂或化学趋向方式侦 察到几丁质f’内存在；(2]对几丁质l’内接近与附着；(3)表达与此聚合物代谢相关的各种酶类或 其它蛋白；(4]对最终水解产物Ⅳ_乙酰葡萄糖胺的吸收和利用【5】。第三个步骤就涉及到几丁质 circulans)、粘质沙雷 酶的诱导表达。许多高效降解几丁质的细菌如环形芽胞杆菌(Bacillus 氏菌(Serratiamarcescens]、交替单胞菌(Alteromonas sp．)在几丁质的存在下，能诱导产生多 种不同表达水平和不同活性的几丁质酶来协同降解底物(不同结晶度的几丁质诱导能力相差很 大)。粉状晶体几丁质的诱导作用大大提高了分泌溅酶的总酶活，胶体几丁质的诱导能力则相对 刳些。而当培养基中|司时含有粉状晶体几丁质和Ⅳ_乙酰葡萄糖胺时，总酶活却几乎检测不到， 说明Ⅳ-乙酰葡萄糖胺抑制了酶的表达【6]。其它发酵结果还表明葡萄糖也是负训因子【6’7I，瓶几丁 +863资助课题(2002AA625010) l： 术通讯作者：t风、r，Emai fengpingw@yahoo．com 272 疆建覆丹 第三届海洋生物高技术论辰 200s．08．19．23 _糖则是正调因子【6】。与粘质沙雷氏菌不同，在哈维氏弧菌(Vibrio 、费尼斯弧菌 harveyi)