分子生物学 教学课件 作者 郜金荣 主编 第十章 分子生物学研究技术.pptVIP

尚辅网 尚辅网 第十章 分子生物学的研究方法  本章概要： 生物大分子的分离，标记示踪剂，核酸杂交，转录子的作图和定量分析，体内测定转录速率，DNA和蛋白质的相互作用，基因工程的基础和原理。 第一节 生物大分子的分离 一、凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 DNA凝胶电泳。由于DNA带有磷酸基团，DNA通常带有负电荷，所以DNA在凝胶中是从负极向正极移动的。由于DNA分子大小不同，小分子DNA在凝胶中移动时受到的阻力要比大分子DNA小，所以电泳结果DNA按其分子大小分布。通过荧光染料将DNA染色，就可以在紫外光照射下观察凝胶上DNA的分布情况。 未知分子量大小的DNA通过和已知标准分子量大小的DNA一起凝胶电泳，然后观察比较它们在凝胶上的位置就可以判断未知DNA分子量大小。同样的凝胶电泳分离原理也适用于RNA。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 在蛋白质的分离中，电泳所用的凝胶通常是聚丙烯酰胺。 二、双向凝胶电泳 双向凝胶电泳（two dimensional gel electrophoresis, 2-DE）可以提高单向变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析能力。 双向电泳由于具有高分辨率和高灵敏度已成为分析复杂蛋白混合物的基本工具。双向电泳的第一向电泳是等电聚焦电泳(isoelectricfocusing，IEF)，然后通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE) 对蛋白质进行第二向电泳；在IEF中，蛋白质因等电点不同而被分离；在SDS－PAGE中，不同分子量的蛋白质相互间被分离开，再用考马斯亮兰或银染进行检测，经Pdquest等软件对结果进行比对、解析。 三、离子交换层析 离子交换层析（ion exchange chromatography, IEC）是根据物质自身所带电荷的不同进行分离的层析技术。如二乙基氨基乙基－交联葡聚糖（DEAE-Sephadex）层析就是使用带有正电荷的二乙基氨基乙基（DEAE）的带电基团作为树脂填料来分离物质。这些带有正电荷的DEAE-Sephadex吸附带有负电荷的物质如蛋白质并与之相结合。这些带有负电荷的物质所带的负电荷越多，它们之间的结合也就越紧密。 离子交换剂是通过化学反应将带电基团引人到惰性支持物上而形成的，如带电基团呈正电，则能结合阴离子，称为阴离子交换剂(anion exchanger)。由于被分离的各种离子所带电荷的多少不同，它们对交换剂的亲和力就有差异，因此经过不同浓度离子的交换与洗脱过程，使不同的离子依先后顺序被洗脱下来，从而达到分离目的。 同样原理，也可以用带有负电荷的离子交换树脂来对包括蛋白质在内的带有正电荷的物质进行分离。离子交换层析中，基质上带有负电荷的基团，称之阳离子交换剂（cation exchanger）。 四、凝胶过滤层析 凝胶过滤层析 (gel filtration chromatography) 又称排阻层析（molecular-exclusion chromatography）或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。 第二节 标记示踪剂 一、放射自显影 放射自显影（radioautography；autoradiography）的原理是利用放射性同位素所发射出来的带电离子(α或β粒子)作用于感光材料的卤化银晶体，从而产生潜影，这种潜影可用显影液显示，成为可见的像，因此，它是利用卤化银乳胶显像检查和测量放射性的一种方法。分子生物学家用得最多的乳胶胶片是X光片。 精确检测DNA片段中放射性的量 通过观察放射自显影条带的深浅来粗略估计，也可以用光密度计扫描放射自显影条带进行准确估计。 磷光成像 (phosphorescence imaging) 的工作原理在于：同位素标记的杂交结果在磷屏上曝光，曝光是32P等核素核衰变同时发射β射线，首先激发磷屏上分子，使磷屏吸收能量分子发生氧化反应，以高能氧化态形式储存在磷屏分子中。激光扫描磷屏，对于激发态高能氧化态磷屏分子发生还原反应，即从激发态回到基态时多余的能量以光子形式释放，从而被探测器捕获进行光电转换，磷屏分子回到还原态。  计算机接受电信号，经处理形成屏幕图像这是一个伪彩色图，不同颜色代表不同的放射性强度，从最低的黄色到最高的黑色。磷光成像灵敏度较X光片高数十倍，可以检测最弱的信号。 三、液体闪烁计数 液体闪烁计数（liquid scintillation counting , LSC）就是利用放射性同位素发出的射线与物质相互作用，从而直接或间接地产生电离和激发等效应，产生能被光电倍增管检测到的光子。 四、非放射性示踪 放射性示踪剂最大的优点就是灵敏度高，不过现在很多非放射性示踪剂( non-radioact