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动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定 郝春霖 （武汉大学药学院，2009302590232） 摘要：采用盐溶法和有机溶剂抽提分离纯化猪肝基因组DNA，并利用紫外吸收和二苯胺显色法进行核酸定量和纯度测定。制备的样品A260/ A280值在1.8附近，纯度较高。但由紫外吸收法数据计算出样品DNA浓度远大于二苯胺显色法的计算结果，本文对数据差异做了相关讨论。 Abstract：The genomic DNA of poker liver were isolated and purified by salting-in and organic agent extraction method. In order to determine the quantitative and to test the fineness of our sample, it has been reacted with diphenylamine to produce the color product and exposed to the UV to find its O.D value. The A260/ A280 value of the sample is about 1.8, which indicates itself highly purified. However, the data of the two different methods are so different that it confuses us. This essay discusses the differences deeply and analyzes the reasons for the results. 关键词：猪肝 盐溶法 抽提 基因组DNA 紫外吸收法 二苯胺 Key words: poker liver salting-in method extract genomic DNA UVpcx diphenylamine 引言： 制备组织基因组DNA在基因结构和功能的研究中扮演着重要角色，是分子生物学研究中最重要的实验操作技术之一，样品分离纯化的程度对后续实验结构起到决定性作用；而不同种类生物的基因组DNA提取方法各异，同一生物的不同组织或器官也因其细胞结构及成分差异，而需采用不同的提取方法。通常要求所得到的DNA片段长度应不小于100kb,在提取过程中要尽可能排除可使DNA断裂和降解的各种物理、化学或生物因素，以保证样品以结构的完整。 盐溶法是制备基因组DNA的常规操作技术，在溶解细胞，核蛋白释放后，根据DNA不溶于0.14mol/L NaCl溶液而RNA可溶的特性将DNA核蛋白与RNA核蛋白分离，得到粗品。粗品中主要成分为DNA和蛋白质，用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，可除去其中的蛋白质。再加入一定量的异丙醇或乙醇，较长的基因组DNA分子将形成纤维状絮团漂浮其中，而质粒或细胞器中的小分子DNA则只能形成颗粒状沉淀物附着在容器壁或底部，用玻棒挑出纤维状絮团即可达到比较满意的分离效果，得到纯度较高的基因组DNA。 核酸中嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统在260nm处有最大吸收峰，故可采用紫外光吸收法对样品进行定量和纯度测定。本文还利用二苯胺与核酸的颜色反应对样品进行了定量测定。 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 722S型可见光光度计、紫外分光光度计、冷冻离心机、水浴锅、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、离心管、EP管等。 SC缓冲液，5%SDS溶液，95%乙醇、氯仿、异戊醇，固体氯化钠等。 1.2 材料 新鲜猪肝 1.3 猪肝基因组DNA的分离纯化 取新鲜猪肝4.0g，用SC缓冲液洗血，低温剪碎后，加入8.0mLSC溶液捣碎，将匀浆装入离心管，平衡后于4000r/min离心10min，弃上层RNA提取液；将下层加入SC溶液5.0mL混匀、平衡后，再次于4000r/min离心10min，弃上层；下层沉淀转入三角瓶，加入SC溶液20.0mL，3mLSDS溶液混匀，15mL氯仿/异戊醇混匀；再加入固体氯化钠1.2g，边加边混匀，充分震荡30min；于4000r/min离心20min；取出离心管后可观察到内容物分为三层，取上层水相（DNA溶于水相中），加入等体积氯仿/异戊醇振荡10min，于4000r/min离心20min；取上清，加等体积95%冷乙醇，边加边向一个方向缓缓搅拌，可观察到纤维状絮团逐渐缠绕在玻棒上。用玻棒挑出DNA絮团，用少量95%乙醇淋洗一次后，轻轻挤压排尽吸附的乙醇，将絮团装入EP管，加1mLSC溶液封存。 1.4紫外吸收法 取1.3中样品，加入10mL NaOH，8000r/min离心5min，取上清进行稀释，当稀释比为1：