壳聚糖介导基因转染研究.pdfVIP

壳聚糖介导的基因转染研究 宗莉 张淑芸 袁喜英 杨晓容 （中国药科大学药物制剂研究所南京 210009 ） 基因载体对基因治疗的成功起着关键的作用，基因载体分为病毒载体和非病毒 载体，尽管病毒类载体有高的转染效率，但在临床上暴露出的病毒重组、免疫原性 和致瘤性等问题，阻碍着它的进一步发展，近年来，人们致力于寻找安全有效的非 病毒类载体。 壳聚糖(CS)是一天然阳离子多糖，具有无毒、生物相容和生物可降解性，因分 子中的葡糖胺基而荷正电，易与荷负电的 DNA 通过静电作用凝聚为多聚复合物 （Polyplex ），使 DNA 压缩成结构相对致密的纳米级粒子，这种纳米粒能有效保护 DNA 在体内转运中免受核酸酶降解，通过细胞内吞途径将基因递送入细胞。就当前 国内外研究现状，壳聚糖作为基因载体存在着转染率低的问题，本文以增强型绿色 荧光蛋白质粒基因作为报告基因进行细胞转染试验，探讨影响壳聚糖转染的相关因 素，寻找提高转染的思路。 1 药品与仪器 壳聚糖 （Chitosan ，简写CS ，Mr: 5; 173; 425KDa, 脱乙酰度: 95.5% 南京林产化 学工业研究所）；增强型绿色荧光蛋白质粒基因-C3 （简称pEGFP 本室扩增和提纯）； 梭华-sofast 脂质体转染试剂 （厦门太阳马生物工程有限公司）；DMEM细胞培养基 （Gibco公司 美国）；小牛血清 （Hyclone公司 美国）；人胚胎肾细胞 （HEK293 中 国药科大学新中新药研究中心惠赠）；FACScan 流式细胞仪 （Becton Dickinson公司 美国）；LX71倒置荧光显微镜（Olympus公司 日本） 2 试验方法 2.1 pEGFP/CS 纳米粒的制备 CS 溶解在5mM NaAC 缓冲液（pH5.5 ）中制成浓度为200 mg/L 的溶液，与含 5mM Na2SO4 的pEGFP 溶液（80 mg/L ）分别预先加热到50-55℃，等体积迅速混合， 涡旋30s，室温放置30 min ，即得N/P 比（CS 中胺基/pEGFP 中磷酸基之比）为5 的pEGFP/CS 纳米粒。 2.2 pEGFP/脂质体复合物的制备 吸取浓度为5mg/ml 脂质体溶液 10µl 于eppendorf 管中，加DMEM 培液适量使 成250µl ，与浓度为80µg/ml pEGFP 溶液等体积迅速混合，涡旋30s，室温放置30 min ， 即得pEGFP/脂质体复合物（pEGFP 与脂质体重量比为2 : 5 ）。 2.3 细胞培养 HEK293细胞用含10％小牛血清、100 mg/L链霉素、100U/ml青霉素的DMEM培 5 养液于37℃、5 ％CO2 潮湿空气中常规培养。以每孔2 ×10 个细胞密度接种24孔细胞 培养板，在37℃、5%CO2 的培养箱中培养18-24h，待细胞汇合度达到70-80 ％即可用 于试验。 2.4 转染方法 每孔中加入100µl pEGFP/CS纳米粒或pEGFP/ 脂质体复合物，400µl 无血清 DMEM培液，置37℃，5 ％CO2培养箱中孵育4 h后，移去样品溶液，细胞用培液洗涤 一次，加入含10%小牛血清DMEM 培液1ml 继续培养44h ，0.2ml胰酶消化细胞， 1500rpm 离心5min ，加入0.25ml生理盐水制备单细胞悬液，上流式细胞仪检测10000 个细胞中荧光染色细胞数，计算转染百分率。结果以平均值±标准差表示(n = 4)， 采用Tukey ′S-test 分析数据，p ≤0.05判定为有显著性差异。 2.5 转染试验 2.5.1 N/P 比对转染的影响 CS Mr 为173KDa，按2.1 项下方法制备N/P 比分别为0.5、2 、5 和7 的pEGFP/CS 纳米粒，激光粒度仪测定各样品的平均粒径和Zeta 电位。进行细胞转染试验。 2.5.2 CS 分子量对转染的影响 CS Mr 分别为5、173