三倍体狗牙根的细胞悬浮培养与体细胞变异体的研究.pdfVIP

中国草学会草坪专业委员会学术研讨会论文与摘要集 三倍体狗牙根的细胞悬浮培养及体细胞 变异体的研究 卢少云，郭振飞，彭新湘 (华南农业大学生命科学学院草业生物技术实验室．广州510642) 。狗牙根(Cynodonspp．)是最重要的暖季型草坪草之一，广泛应用于热带亚热带地区的 绿化及水土保持。三倍体狗牙根主要应用于高尔夫球场及运动场草坪，由于不能形成种子， 营养繁殖是其唯一的繁殖及应用方式，传统杂交育种改良因而受到限制，利用现代生物技术 对现有品种进行改良也就显得尤为重要和必要。但无论是采用细胞工程还是基因工程方法培 育作物新品种，大都需要建立植物细胞或原生质体培养及植株再生方法。 本研究以三倍体狗牙根品种Tifeagle的匍匐茎节为外植体，接种在愈伤组织诱导培养基 Vitamin(Sigma)成分为基本 (N6无机大量成分，MS无机微量成分，MS铁盐，Gamborgs 培养基，附加6．6mg／L的dicamba，0．6mg／L的BA，水解乳蛋白O．5g／L，谷氨酰氨O．5g／t,， 脯氨酸0．5 5．8)上。外植 g／L，肌醇O．1g／t,，蔗糖30g／L，琼脂7g，培养基灭菌前调至pH 体大约一个月后在茎节处大多形成自色、松软泡状的非胚性愈伤。与此同时有些外植体在靠 近茎节处还会形成非常紧实的、灰白色的胚性愈伤组织小块。将这些胚性愈伤小块剥离出来 转入液体继代培养基(成分与愈伤继代培养基成分相同，只是不加琼脂。)中悬浮继代。液 体培养时摇床转速控制在20—30r／rain，每5-7d悬浮继代一次。结果表明，与固体继代培 养相比，悬浮继代的增殖速度更快，得到的愈伤状况也更好。而固体培养不仅增殖慢，而且 还会重新形成松软、水泡状的非胚性愈伤，这样的愈伤不能再生出植株。另外，固体培养过 程中容易出现褐化，有时形成褐色物质后该部位胚性愈伤的生长会因而受到抑制。采用上述 液体悬浮继代培养系统可以获得大量高质量的愈伤组织，满足基因转化的需要。利用该系统 可以实现对离体细胞长时间的连续悬浮继代培养以诱发体细胞变异体的发生，经18个月以 上的连续悬浮继代后，愈伤分化再生率仍可高达80％以上，为定向筛选突变体奠定基础和 前提。 以液体悬浮继代培养8-10次的愈伤组织和经分化培养0、1、2和7d的狗牙根愈伤组 织为材料，进行光学组织切片和扫描电镜切片观察，不仅从形态学上观察到表面的体细胞胚， 还观察到体细胞胚发生过程中不同时期胚的结构，从而证明了体细胞胚胎发生途径是三倍体 狗牙根Tffeagle茎节离体培养组织的一种再生方式。 从再生植株中观察到植株形态发生了明显变异，例如筛选获得了’rv4等矮化变异体。 不同年份的越冬过程中多次获得了较高的得分．这些株系值得进一步试验，以育成新品种。 研究结果同时也说明，通过对狗牙根愈伤组织进行长时间连续继代悬浮培养能有效地诱导体 细胞变异，并能从再生植株中筛选出有益的性状。 和教育部优秀青年教师基金等资助．