人类膜结合型透明质酸酶(PH20)促进肿瘤生长研究.pdfVIP

NCL啊 2004 论文汇编 CCCCLM 群瘤标志糍 C：B-1 人类膜结合型透明质酸酶(PH20)促进肿瘤生长的研究 高锋刘娇娇刘一文李成海 贾立宁 上海市交通大学附属第六人民医院检验科200233 透明质酸酶(HAase)在人体内广泛分布于血清、脑和胎盘等 组织和体液中，按照pH值对酶活性的影响可分成两类。一种是酸 性溶酶体HAase，最适pH值3．0，在pH值中性时没有活性；另一 类HAase最适pH值呈中性，仅发现存在于精子细胞表面，其他 组织该类酶不表达，其主要作用是促进精子的游动。人精子细胞 形成后，小心取下肿瘤块，称重，留取部分做冰冻切片，免疫组化 膜结合型透明质酸酶(PH20)是1983年Primakoff首次发现并命 名的(1)。1993年克隆其基因，证实PH20是一糖基化磷脂酰肌醇膜 血管数量，与对照组比较。 蛋白，或称之为膜结合型透明质酸酶(Membrane—bound五、Westom hyaluronidase)。 1996年Liu等。发现，PH20出现在那些具有转移能力的恶 并蛋白定量，两组细胞以精确同样蛋白量(30pg／带)作聚丙酰胺 性肿瘤细胞膜上，而低恶性不转移肿瘤细胞则不表达PH20。作者凝胶内电泳，常规Western 并未对其机制进行进一步研究．机制不清。如果这是一种“规律” UK)显示结合信号。 ，则PH20对癌细胞的转移可能起着重要的作用。对于这一现象， 六、 目前研究较少，国外仅有4篇文献报道。就PH20与肿瘤之间的 关系，各家报道一，有研究发现PH20也表达在部分“癌旁正常组 织”∞。究竟PH20与肿瘤细胞转移和生长之间是否有必然的联 系，或是偶然现象?目前缺乏定论。本课题就这一问题展开初步探 讨，旨在探明PH20与肿瘤细胞生长或转移之间的关系。 事}料与方法 一、材料和试剂：内切酶，Promega公司；人乳腺癌细胞株 MDA23l、肾上腺癌SWl3、正常人胚肾细胞293，购自美国ATCC(ng／m1)。 公司；羊抗人yonWillebrand Research factor(vWO，美国Enzyme 11 Laboratories；质粒pBluescriptSK(+／一)／PH20(含人全长PH20 cDNA)、生物素标记透明质酸结合蛋白(biotin—HABP)和PH20多 克隆抗体由美国乔治城大学DrCBUnderhill惠赠；真核细胞表上．实验同前。 达质粒pcDNA3，美国Stratagene 八、PH20对SWl3肿瘸细胞增殖的作用：PH20cDNA转 CloningSystem公司；FGF一2多 Gruz 克隆抗体，Santa BioteehnologyInc．公司；FGF一2ELISA测入SWl3肿瘤细胞后，以每天计数两组细胞数量作为观察SWl3 试盒，RD System公司；十天鸡胚，上海大江养殖厂。五周龄裸鼠增长的指标。 无菌条件下培养。 九、PH20对人胚肾293细胞生长的影响：四甲基偶氮唑蓝 II SK(十／一)／ 二、PH20表达质粒的构建：质粒pBlueseript 1一his。细 PH20eDNA插人片断由BamHI和Xhol酶切下，用同样内切酶切 pcDNA3，电泳产物经DNA快速纯化试剂盒回收。加T4噬菌体 DNA连接酶，14℃筛选pcDNA3／PH20重组体，双脱氧链终止法5％CO：培养，期间每天更换培养液。每隔12hr取出一板如下呈 ABI DNA测序仪测定阴20eDNA。 色测定：每孔加入5mg／ml 三、PH20cDNA转染细胞及表达鉴定：基因转染采用