小梁细胞体外培养实验研究.pdfVIP

纤维蛋白溶解酶和Dispase蛋白酶诱导兔眼 玻璃体后脱离的实验研究 黄玲 王育良 王友法 江苏省中医院眼科(210029) 王丽丽 西安市第四医院眼科 王海燕 第四军医大学眼科 [摘要】目的研究纤维蛋白溶解酶和dispase蛋白酶诱导玻璃体后脱离的作用。方 法24只健康成年的青紫兰兔随机分为4组，右眼均为实验眼，左眼为对照眼。A组实 球进行光镜、扫描电镜和透射电镜观察。结果 电镜结果A组2只实验眼后极部发生不 网膜组织结构正常，均未发现明显异常改变。而Dispase蛋白酶各组透射电镜观察视网膜 的毒性作用。 [关键词]纤维蛋白溶解酶；Dispase蛋白酶；玻璃体后脱离 小梁细胞体外培养实验的矾究 曾红艳 彭清华 湖南中医药大学第一附属医院眼科(410007) 青光眼是一种较为复杂的眼病，绝大多数患者具备的共同体征是眼压升高、青光眼性 视野改变和视网膜视神经受损害㈨。目前青光眼的主要治疗方法仍以手术或药物降眼压 治疗为主，以减少疾病进行性损害的可能性。而引起眼压升高的机制相当复杂，可能包括 小梁细胞外基质堆积、细胞吞噬功能下降、离子通道表达和分布异常有关。 在发达国家中，青光眼得到诊治后仍有每年3％的患者病情继续恶化。青光眼降眼压 188 治疗后，小梁的细胞保护是应该进行的后续治疗模式。现代中、两医学者均在探索某种保 护小梁细胞的有效办法，但仍然处于实验阶段，到目前为止，临床尚无保护小梁细胞的专 用制剂。为了探讨中医药对青光眼小梁细胞的保护作用，我们对人眼小梁细胞体的外培养 实验进行了研究。 1材料与方法 小梁细胞的体外培养实验，参照薛蔚等的培养方法…。 1．1人眼小梁组织的取材 眼球来源于突然死亡、无眼病史者。年龄20一35岁，死亡48小时以内。在消毒条件 下取出眼球，用生理盐水500m加庆大霉素16万u充分冲洗眼球后，在洁净工作台上， 解剖显微镜下于角膜缘后3～4ram处环形剪开眼球，翻转眼前节，将角膜内皮面向上置于 显微镜下，去除前部葡萄膜、晶体，清除房角处粘连的组织和色素，辨明Schwalbe线和 略显白色的巩膜突。二者之间为小梁网。用显微手术剪分离浅层小梁网组织，把自制的细 仔细分离小梁网。 1．2小梁细胞培养方法 XlmmX 将小梁组织块剪成约2mm Imm大小，移入25ml的培养瓶中，使其在瓶底均 匀分布，吸干培养液，翻转培养瓶，室温下让组织块贴壁30～50分钟，加入DMEM培养 C02、95％空气、接近饱和湿度的孵箱中培养。培养细胞从组织块生长出后每5—7天换 培养液，至细胞局部融合。每日以光学显微镜观察。 1．3细胞传代方法¨1 小梁组织块周围细胞生长达到局部融合后，按1：1或者1：2传代，以后视情况按 l：3～1：5传代。吸出培养液，用D 白酶少许，静置5一10分钟。在相差显微镜下观察，见细胞浆收缩，细胞变圆，立即加入 含血清的培养液3～5ml，中止消化。用玻璃尖吸管轻轻吹打瓶底，使细胞从培养瓶中脱 落并形成均匀细胞悬液，置入培养箱中；第2天观察细胞大部分贴壁，小心弃去上清液加 人含20％胎牛血清的培养液，进行第2代培养。以后按常规传代培养。 1．4细胞超微结构的观察 加入含10％胎牛血清的培养液终止消化，轻轻吹打培养瓶底，使细胞从瓶底脱落，移出 2％多聚甲醛混合液固定，送电镜室进一步处理，经常规乙醇和丙酮逐级脱水，环氧树脂 618包埋，LKB—V超薄切片机切片，醋酸铀、枸橼酸铅双染后，行透射电子显微镜观察 细胞超微结构并摄片。 1．5小梁细胞爬片的制作 X 取传三代近融合的细胞用0．25％的胰蛋白酶消化后以4105个／ml细胞的浓度传代 接种于预置有消毒盖玻片的6孔培养板中，继续置于37％，5％C02培养箱中培养直至近 l89 每次3min，可立即进行检测或一20℃冰箱保存备用。 1．6小梁细胞鉴定的方法 采用细胞免疫化学染色法。在24孔培养板中取出覆有细胞的盖玻片，以4％多聚甲 使用的第一抗体