生物组织冷冻保存过程中CPA导入程序研究.pdfVIP

生物组织冷冻保存过程中CPA 导入程序的研究 1 1* 1 1 1 1，2 马学虎 刘洋 柏巍 葛丹 刘天庆 崔占峰 (1 大连理工大学化工学院干细胞与组织工程实验室，大连 116024 2Development of Engineering Science,Oxford University,Parks Road,Oxford OX1 3PJ,UK) 引 言 组织工程(Tissue Engineering)是近年来正在兴起的一门新学科，属于生物高技术范畴。 它是应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的 组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤 后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。生物组织的低温保存正是组织工程所赖以生 [1] 存的技术 。 生物体的低温保存，是指将活的生物体采用特殊的方法冷却至低温（一般是低于-70℃ 的超低温）后长期保存[2] 。待需要时，将其按照一定的程序复温至正常温度。低温冷冻目前 [3] [4] [5] [6] [7] 已广泛用于长期保存血管 、血液、精液 、骨髓、胰岛、肾脏 、胚胎 、表皮 、心脏组 织和卵巢组织[8]等。 据统计，骨移植是临床上仅次于输血的组织移植，临床需求量大，但供体相对较少， 供骨不足[9] 。尽管现有的骨移植技术已经较成熟，大块骨缺损依然是整形外科和重建手术中 需要解决的问题[9] 。在自体骨嫁接或异体骨移植过程中，需要将骨组织保存起来以备用时所 需。骨库的建立，即将事先采集、贮存并经过处理的同种骨甚至异种骨用于治疗，为临床使 用安全有效的骨移植材料提供了促证。 无论是细胞还是组织的超低温冷冻，其过程都大致相同，即包括冷冻保护剂的导入、 冷冻（保存）、复温、冷冻保护剂的洗脱。多年的研究表明，冷冻保护剂是超低温冷冻过程 中不可缺少的试剂，除了极简单的微生物、病毒和细菌以外，绝大部分的细胞和组织在缺少 冷冻保护剂保护的情况下是无法承受超低温冻存这个过程而仍然保持其生物活性的，因此对 组织进行超低温冻存前的预处理是保证冻存后有较高的细胞存活率和较高的组织活性的前 提。 另外，在冷冻保护剂导入过程中细胞膜两侧溶液浓度的不平衡如果达到一定程度的话 就会对细胞膜造成不可逆的损伤，彻底破坏细胞膜的半透性，如果由于细胞膜外溶液浓度的 变化造成的细胞脱水或肿胀达到一定程度的话，细胞就会死亡。因此，合理的设计冷冻保护 剂的导入方法很关键，既要尽可能降低冷冻保护剂的毒性，又要尽可能维持细胞膜两侧溶液 浓度的平衡。 对于悬浮细胞来说，CPA 的导入仅仅涉及细胞膜两侧的渗透，所以悬浮液中各个地方 的渗透过程差别不大；而对于组织来说，随着宏观物力尺度的增大、组织结构的复杂，其间 * 联系人：刘洋 Corresponding author: Prof. LIU Yang E-mail: liuyang0899@ CPA 的渗透不仅涉及细胞内外的渗透，还包括细胞之间（组织表面和内部）的CPA 渗透平 衡。而 CPA 的洗脱可以看作是导入过程的逆过程，处理不当同样会使因为细胞内外渗透压 差异和CPA 的毒性导致细胞的死亡。 冷冻保护剂导入的方式大体有两种：一步法和浓度梯度法。对于低浓度的冷冻保护剂 来说，由于浓度不高，对细胞或组织不会造成很大的渗透休克，不会破坏细胞膜的半透性， 因而可以一次性的导入，即一步法。但对于高浓度的冷冻保护剂来说，一次性加入会使得细 胞膜两侧的渗透压差过大，细胞迅速脱水，到一定程度后则导致细胞死亡。因此通常都会分 多步导入，依次升高冷冻保护剂的浓度，即浓度梯度法。浓度梯度法到底要分成几步来完成， 这和要保存的细胞或组织的种类，冷冻保护剂的种类、浓度均有关系。另外普遍认为降低导 入温度可以降低冷冻保护剂对细胞或组织的毒性，但究竟温度对导入过程是否还有其他的影 响还有待于研究。因此冷冻保护剂导入的方案到目前为止也没有一个公认的标准和令人信服 的理论。 本实验正是针对冷冻保护剂导入过程中的一些有待研究的方面，以 3 天龄 SD 大鼠颅 骨的顶骨为对象，通过控制导入过程中的几个关键性参数，来考察骨组织冷冻保护剂导入过 程的特性。实验选