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维普资讯 菌 物 系 统 20 3‘)：342-346． 2001 Mycosystema mRNA差别显示技术分离草菇低温诱导基因 陈明杰 谭 琦 曹 晖 王 南 。 黄为一 潘迎捷 南京农业^学资环学院 南京 201100： 农业部食用菌遗传育种重点开放实验室．上海市农业遗传育种重点开放实验室 上海市农业科学院食用菌研 究所 上海 201106) 摘要：本文报 道采用改 良的mR~NA差别筛选}去．通过选用 3’锚定引物和 18．25碱基的 PCR随机 引 物组合，以琼脂糖凝胶 电泳，EB 显色替代聚丙烯酰胺凝腔电泳和放射 自显影，对低温处理草菇 (Volvarieltavolvace 及正常草菇基因表选进行筛选、分析，结合 ILNA斑点杂交技术加 以验证，分 离得到7O个草菇低温诱导 DNA片段： 关键词：草菇；mlLNA差别筛选法 低温诱导 中国分类号 ：093996 文献标识码 ：A 文章编号：1007—3515(2001)03—0342-0346 1992年 Liang和 Pardeg根据高等生物成熟 的mRNA都带有 polyA的特性 ，用特定的锚定引 物反转录后 ，进行 PCR扩增，建立了mRNA差别显示技术(mRNA differentialdisplay， mRNA DD．PCR)(Liang，1992) 目前 已经报道用该技术发现 的新基因超过 300个，显示 了它 的优越性和 良好的发展前景f叶纨芝 1999) Liang等所建立 的DD．PCR技术用 6％的测序聚丙烯酰胺凝胶 电泳，扩增时要加入 同位素，还 要放射 自显影 ，因此实验周期长、成本高、易造成环境污染，实验 的限制 因素较多；本文通过对 PCR 引物的改良，用琼脂糖凝胶 电泳，EB显色替代聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射 自显影，使得工 作大大简化。应用这一技术，分离得到70个草菇低温诱导 DNA片段 。 1材料与方法 1．1 供试草 菇殛其草菇菌株 草菇(Volvarieflavofvacea)V23采 自上海草菇产地南汇县 草菇菌株V23由供试的南汇草菇中 经组织分离获得，并由本所菌种保藏 中心保藏。 1．2 草菇菌丝体培养 草菇菌株接入 PDY液体培养基 (马铃薯 20％，葡萄糖 2％，酵母提取物 O．1％)，32℃恒温静止培养 5d后，一部分草菇菌丝在 4℃低温分别处理 1、2、3、4h。用 400目的滤网过滤收集草菇正常菌丝 和低温处理菌丝，菌丝用无菌蒸馏水冲洗数次，用滤纸吸干水分，于．70~C冷冻 2h后 ，在 T=．55 ℃、P=3×l00mba的条件下，于冷冻干燥机 (EDWARDS，英 国)中冷冻干燥 24h，得到草菇样 品的干燥菌丝 ，于．70C保存 1．3 草菇蓖丝体总 RNA的制备 采用 TRIzol试剂 (上海 华 舜生物 工 程有 限 公司 )对草菇样 品进行 RNA 制各 。提纯的 RNA利用 RQ1RNase．FreeDNase(Prornega)去除 DNA，得到纯化的 RNA。 奉项 目由上海市科学技术发展基盘资助．项 目编号：00392【076 收原稿 日期：20014)l-30-收修改稿 日期：200L-03—29 现 在通 讯地址 ：农 业都食 用菌遗 传育种 重点 开放 实验 室．上海 市 农科院食用菌 研究所 ．上 海南华 路 35 号．Email： mingiiechen@chinac0m 维普资讯 三旦 — — 陈明杰等：mRNA差别显示技术分离草菇低温诱导基因 343 1．4 mRNA差别筛选法 1．4．1cDNA合成： eDNA 合 成 反应 总体 积 为 20pl，其 中含 有 50mmol／L Tris．HCI，DH8． 3： 75mmo1／LKCh 3mmol／L MgCIzl0mm0LDTT：0．2mmol／L dNTP：25UnitR_N,A 酶抑制剂 (Promega)~l山50mmol／L反转录锚定引物 (生工)；20Un