mRNA差异显示技术_百替生物.pdfVIP

 mRNA 差异显示技术 mRNA 差异显示技术是由美国波斯顿Dena-Farber 癌症研究所的Liang Peng 博士和Arthur Pardee 博士在1992 年创立的[3]。它也称为差示反转录PCR （differential display of reverse transcriptional PCR ） 简称DDRT-PCR 。mRNA 差异显示技术是将mRNA 反转录技术与PCR 技术二者相互结合发展起来的 一种RNA 指纹图谱技术，具有简便、灵敏、RNA 用量少、效率高、可同时检测两种或两种以上经不 同处理或处于不同发育阶段的样品[4]，该方法自问世以来已被广泛用于差异表达基因的克隆鉴定研究 中。其基本原理是，几乎所有的真核基因mRNA 分子的3’-末端，都带有一个多聚的腺苷酸结构，即 通常所说的poly(A)尾巴。因此，在RNA 聚合酶的作用下，可按mRNA 为模板，以oligo(dT)为引物合 成出cDNA 拷贝。根据mRNA 分子3’-末端序列末端结构的分析可以看到，在这段poly(A)序列起点碱 基之前的一个碱基，除了为A 的情况之外，只能有C、G、T 三种可能。根据这种序列结构特征，P. Peng 等人设计合成三中不同的下游引物，它由11 个或12 个连续的脱氧核苷酸加上一个3’-末端锚定脱氧核 苷酸组成，用 5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A 表示，这样每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都将能够把 总mRNA 群体的1/3 分子反转录成mRNA-cDNA 杂交分子。于是，采用这三种引物，可以将整个mRNA 群体在cDNA 水平上分成三个亚群体。然后用一个上游的随机引物和与反转录时相同的oligo(dT)引物 对这个ｃＤＮＡ亚群体进行ＰＣＲ扩增，因为这个上游的引物将随机结合在 cDNA 上 ,因此来自不同 ｍＲＮＡ的扩增产物的大小是不同的，可以在测序胶上明显分辨开来，从而筛选出不同样品间基因差 异表达的DNA 片段（如图1）。 随着mRNA 差异显示技术的广泛应用，也逐渐显露出一些不足之处，如所得特异性cDNA 片段 克隆的假阳性的比例较高，差异条带分离困难，获得的差异扩增片段一般在100bp~600bp 太短之间， 包含大量的非编码序列，不利于同源性比较分析等。 以下是以红豆杉为例进行m ＲＮＡ差异显示研究的具体操作。 service@100 图1 DDRT-PCR 原理图 １实验材料 １．1 红豆杉细胞 未经MJ 诱导处理的A1和经MJ 诱导处理的B1红豆杉细胞。 １．2 寡核苷酸引物 （1）3 ’锚定引物： ①H-T11A(2uM): 5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’ ②H-T11C(2uM): 5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’ ③H-T11G(2uM): 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’ （2 ）5’ 随机引物： Kit 引物： ①H-AP1(2uM): 5’-AAGCTTGATTGCC-3’ ②H-AP2(2uM): 5’-AAGCTTCGACTGT-3’ ③H-AP3(2uM): 5’-AAGCTTTGGTCAG-3’ ④H-AP4(2uM): 5’-AAGCTTCTCAACG-3’ ⑤H-AP5(2uM): 5’-AAGCTTAGTAGGC-3’ ⑥H-AP6(2uM): 5’-AAGCTTGCACCAT-3’ ⑦H-AP7(2uM): 5’-AAGCTTAACGAGG-3’ ⑧H-AP8(2uM): 5’-AAGCTTTTACCGC-3’ 生工引物： ①H-AP1(2uM): 5’-AAGCTTCATTCCG-3’ ②H-AP2(2uM): 5’-AAGCTTCCACGTA-3’ ③H-AP3(2uM): 5’-AAGCTTCGGGTAA-3’ ④H-AP4(2uM): 5’-AAGCTTGAGTGCT-3’ ⑤H-AP5(2uM): 5’-AAGCTTCGGCATA-3’ ⑥H-AP6(2uM): 5’-AAGCTTGGAGCTT-3’ ⑦H-AP7(2uM): 5’-AAGCTTACGCAAC-3’ ⑧H-AP8(2uM): 5’-AAGCTTTAGAGCG-3’ 特异引物： ①5ac: 5’-GAGTTT