PCR污染及对策.docVIP

PCR污染与对策PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污. 污染原因　　(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶.　　(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水PCR核酸模板污染.(三)PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR产物拷贝量(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物.　　还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染在空气与液体面摩枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由.　　(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简.其污染可能性也很大.　　一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以 便采取措施，防止和消除污染.对照试验　　1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR .阳性 对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳 (100个拷贝以下).但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳 性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳 .　　2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:被检的标本是血清就用 ;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.②试剂 :在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染.3.重复性试验4.选择不同区域的引物进行PCR扩增一． 污染的预防进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：1. 2. PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增；3. 各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。 （二）分装试剂：PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA：1． PCR用水应为高压的双蒸水；2． 引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制；3． dNTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。(三) 实验操作注意事项 1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；2. 使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；3. 4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；5. 6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；7. DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；8.  二． 追踪污染源如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。（一）设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照，100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR敏感性极高，可以从其它方法（Sourthern PCR体系中各试剂的时机对照，即包括PCR反应所需的全部成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中PCR产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。 环境污染中常见的污染源主要有：1. 模板提取时真空抽干装置；2. 凝胶电泳加样器；3. 电泳装置；4. 5. 切胶用刀或手术刀片；6. 离心机；7. 此