实验十 质粒DNA的转化.docVIP

教案首页 第__3__次课 授课时间：2006年1月13日～11月16日 课程名称 生物化学与分子生物学实验课 年级 2006 专业、层次 临床医学本科 授课教师 许成山 职称 课 型(大、小) 小 学时 4 授课题目（章、节） 实验十 质粒DNA的转化 基本教材或主要参考书 自编 《生物化学与分子生物学实验指导》 教学目的与要求： 1、学习重组DNA转化的基本操作； 2、巩固基因工程的有关知识，加深理解转化的定义； 3、掌握提高转化效率的基本思路。 大体内容与时间安排，教学方法： 1、质粒的定义及特点 5min 2、质粒DNA转化的定义及原理 5min 3、质粒DNA转化的操作步骤及注意事项 5min 4、学生做实验 145min 教学方法：实验+示教 教学重点、难点： 重点：1、质粒的定义 2、质粒DNA转化的定义及原理 3、重组质粒转化工程菌的筛选 难点：质粒DNA转化的原理 教研室审阅意见： 教研室主任签名： 年 月 日 基本内容 辅助手段和时间 分配 一、实验原理 （一）质粒： 是存在于细菌染色体以外的小型环状双链DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。 （二）转化： 是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子。 （三）感受态细胞的制备原理： 0～4℃，CaCl 2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中（本次实验是人 Bcl-2 重组质粒）的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃ 90秒热激处理，促进细胞吸收DNA得合物。 （四）重组质粒转化工程菌的筛选： 本实验是将人Bcl-2重组质粒转化DH5α扩增菌mp的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。 二、操作步骤 （一）细菌感受态细胞的制备 将DH5α菌种划线于LB琼脂板上，37℃培养过夜。挑取单菌落接种于5ml LB培养基中，37℃振荡培养培养过夜。次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的烧瓶中，37℃剧烈振荡培养至约2～3h，待A600值达到0.3～0.4时将烧瓶置于冰浴10～15min。将细菌转移到一个灭菌处理过的冰预冷的50ml离心管中。4 000×g，4℃离心10min，弃培养基，将管倒置于滤纸使最后的残留液体流尽。加预冷的已过滤除菌的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，置冰浴30min。4 000×g，4℃离心10min，弃培养基。再加4ml预冷的0.1mol/L CaCl2，轻轻重悬菌体，置4℃冰箱12～16h。（已做好） （二）DNA重组子的转化大肠杆菌DH5α 在无菌条件下按每管取100μl新鲜感受态DH5α细菌置于无菌的5ml塑料离心管中，共2管，分别加入人Bcl-2重组质粒(10ng)和消毒水(作阴性对照)各5μl，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min。42℃，热休克90s，冰上2min，中途不要摇动离心管，每管加400μl无抗生素的LB培养基，于37℃空气摇床中以50 r/min速度振摇45min，使细菌复苏。每管取200μl加至含氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂平板上，用玻璃涂布器涂布均匀，室温放置20min，使液体吸收，然后37℃倒置培养12～16h至单菌落形成。 三、注意事项 1、感受态细胞很脆弱，因此制备感受态细胞时，动作一定要轻，禁止剧烈的振摇或吹打。 2、制备感受态细胞时使用的离心管均应为朔料管，禁用离心管，否则转化效率降低10倍。 3、感受态细胞置冰上4℃冰箱过夜，可提高转化效率4～6倍。 4、感受态细胞热休克时间要准确，中途不要摇动离心管。 5、细菌铺板密度过高或培养时间过长，会使一些未转化（不含Amp抗性）的细菌也形成菌落；将氨苄青霉素的浓度提高至100μg/ml可使情况有所改善，但不能彻底根治。 10min 提问 简图 流程图 10min 实验+示教 100min 小 结 把体外重组的DNA引入受体细胞，使受体菌转化为重组DNA的双重抗药性的新的遗传特性，从中选择出重组转化子。本实验综合因素较多，难度较高，在基因工程中是克隆与克隆表达中一