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怎样提取脐血单核细胞的（明胶法）怎样提取脐血单核细胞的（明胶法）分离脐血单个核细胞。我们现在总结出最好的方法是按以下步骤1)先用生理盐水配3%的明胶，高压后用之前再溶化，至37度左右，与脐血等量混合，约30分钟，取上清液 2)2000rpm离心，浓宿细胞 3)用10ml离心管，加入4ml左右的Ficoll分离液后，加浓缩细胞液，2000rpm离心， 4)取中间的白膜层，即为单个核细胞此法是经过我室多种方法的比较后得出的。不会丢失单个核细胞 。 3%明胶和HES的作用应该是一样的，均可加速红细胞沉淀。明胶的作用就是沉淀大量的红细胞. 平均约50ML的脐血最终可以得到单个核细胞2X10E8个细胞这个数量级我想不管做什么实验都足够了.丢失的细胞约1X10E6,几乎不会损失. 随脐血应用范围的逐渐扩大,脐血库的建立事在必行。减小脐血体积最简单的方法是在冻存前去除红细胞。研究发现,明胶沉降法的造血祖细胞回收率较高,同时可去除超过95 %的红细胞。Pick 等[[ 8 ] Pick M, Nagler A , Grisaru D , et al . Expansion of megakaryocyte progenitors from human umbilical cord blood using a new two2step separation procedure[J ] . Br J Haematol ,1998 ,103 (3) :639 - 650. ]设计了一种新的两步法。第一步,用明胶去除大部分红细胞, 第二步,用Ficoll 去除残余的红细胞和中性粒细胞。结果发现,与单用明胶相比,采用明胶+ Ficoll 法在几乎完全去除红细胞的同时,对CD34 + 细胞没有太大影响,而且巨核系祖细胞得到了富集。本实验采用这种方法效果较好第十八章 血细胞分离技术 (Separation technique of the blood cell) 一,原理在体外进行细胞免疫检测时,首先必须进行淋巴细胞的分离.分离淋巴细胞的方法很多,但不管采用哪种方法,均要求分离的淋巴细胞纯度高,产量多,而且不丧失活性,同时也要求分离技术简单,操作方便. 外周血液中红细胞和白细胞的比例在几百甚至上千比一,两类细胞的大小和密度不同,其沉降速度也就不同.红细胞的自然沉降率较快,加入高分子量的聚合物,如明胶,右旋糖酐等还可以加速其凝聚.利用自然沉降法,密度梯度离心法或二者结合,可以将淋巴细胞从血液中分离出来.这种分离出的淋巴细胞一般包括单核细胞.除去单核细胞,可以利用单核细胞的吸附功能,如铁颗粒,玻璃面或尼龙网等,除去(或分离)单核细胞,从而提纯淋巴细胞. 二,采血 (一)材料与试剂 1.抗凝剂 (1)肝素:肝素是含硫酸基的粘多糖,常用其钠盐或钾盐,它能阻止凝血酶原转化为凝血酶,进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白,从而阻止血液凝固.常用的肝素溶液浓度为1 000U/ml,市售肝素多为100U~126U/mg. (2)乙二胺四乙酸(EDTA):是一种螯合剂.用生理盐水配制成4%的溶液备用. (3)阿氏液(Alsever液),配方如下: 枸橼酸钠(Na3C6H5O7·5H2O) 0.80g 枸橼酸 0.0325g 葡萄糖 2.05g 氯化钠 0.42g H2O 加至 100.00ml 混匀溶解后,114.3高压蒸汽灭菌10min备用. 阿氏液中既含有枸橼酸钠抗凝剂,又含有细胞生存的营养,所以它既可做抗凝剂,又可做血细胞的保存液. 2.针头 根据不同动物和采血部位,采用不同型号的针头,用前必须灭菌或消毒. 3.采血容器 注射器或三角瓶等. 4.采血动物. (二)操作方法 1.采血法 各种动物采血方法不一.马,牛,羊等大动物一般从颈静脉采血,猪从颈静脉,前腔静脉或耳静脉采血,家禽由翼下静脉或心脏采血,兔由心脏或耳静脉采血,犬由颈静脉或四肢静脉采血,豚鼠由心脏采血,小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血. 2.抗凝 采集血液最关键的问题是抗凝,采用什么方法进行抗凝,则根据实验的要求和条件而定.最常用的方法如下: (1)肝素抗凝:采血时,使每ml血液含15U~20U肝素即可.计算采集的血液量,按1 000U/ml的量加入肝素,直接放入采血容器中,采血时,边采血边轻轻摇动,使抗凝剂和血液混匀.对于采少量的血液或小动物采血,可直接用注射器抽取一定量的肝素液,再采血直接抗凝. (2)EDTA抗凝:采血前,用灭菌生理盐水将EDTA配制成4%溶液,然后按预采血液的量,以每ml血液加入1mg~2mg的EDTA的液体量于采血容器内.采血,并不断摇动采血容器,使之混匀. (3)玻璃珠法:预先将适量的玻璃珠(根据采血量多少而定)清洗后,装入采血容器中,灭菌后备用.采血过程中,边采边摇采血瓶,以