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酶工程 教学课件 作者 梁传伟张苏勤 主编 胡本高 主审 第四章.ppt 98页

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尚辅网 尚辅网 酶工程 第四章 酶的分离纯化 第一节 细胞破碎 一、机械破碎法 利用机械力的搅拌,剪切、研碎细胞。常用的有高速组织捣碎机(Waring blender)、高压匀浆泵(国外称Manton-Gaulin)、玻璃或Teflon研棒勾浆器(国外称Potter-E1vehem homogeniver)、高速球磨机或直接用研体研磨等。动物组织的细胞器不甚坚固、极易匀浆,一般可将组织剪切成小块,再用匀浆器或高速组织捣碎器将其匀质化。匀浆器一次处理容量约50mL,高速组织捣碎器容量可达500—1000mL左右。高压匀浆泵非常适合于细菌、真菌(如酵母)的破碎,且处理容量大,一次可处理几升悬浮液,一般循环2—3次,足以达到破碎要求。 第一节 细胞破碎 二、超声波法 超声波是破碎细胞或细胞器的一种有效手段。经过足够时间的超声波处理,细菌和酵母细胞都能得到很好的破碎。若在细胞悬浮液中加入玻璃珠,时间可更短些,一般线粒体经过125W超声处理5min可全部崩解。超声波破碎一次处理的量较大,超声效果以探头式超声器较水浴式超声器更佳。超声处理的主要问题是超声空间局部过热引起酶活性丧失,所以超声振荡处理的时间应尽可能短,容器周围以冰浴冷却处理,尽量减小热效应引起的酶的失活。 第一节 细胞破碎 三、渗透压法 渗透破碎是破碎细胞最温和的方法之一。细胞在低渗溶液中由于渗透压的作用,溶胀破碎。如红血球在纯水中会发生破壁溶血现象。但这种方法对具有坚韧的多糖细胞壁的细胞,如植物、细菌和霉菌不太适用,除非用其他方法先除去这些细胞外层坚韧的细胞壁。 四、化学破碎法 化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞膜作用,使细胞膜的结构改变或破坏的方法。 第一节 细胞破碎 1.有机溶剂处理 常用的有机溶剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。 有机溶剂可使细胞膜的磷脂结构破坏,从而改变细胞膜的透过性,再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释出胞外。 例如,将细胞悬浮在10倍体积的预冷至-20℃的丙酮之中,搅拌均匀,待自然沉降后弃上清液,抽滤得细胞,再用2.5倍体积的-20℃丙酮洗涤,抽干后,把得到的细胞立即放入真空干燥器中,除去残余的丙酮,得到细胞干粉,可长期保存,使用时再用水或缓冲液把胞内酶提取出来。常用的大肠杆菌谷氨酸脱羧酶就是用这种方法获得的。 第一节 细胞破碎 2.表面活性剂处理 表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用,使细胞膜结构破坏,增加膜的透过性。 表面活性剂有离于型和非离子型之分,对细胞破碎效果而言,离子型表面活性剂较有效,但由于离子型表面活性剂会使酶的结构破坏,引起酶变性失活。所以,在酶的提取方面一般不采用离子型表面活性剂。而采用非离子型的特里顿(Triton)、吐温(Tween)等表面活性剂。例如,用特里顿X—100处理诺卡氏菌细胞,从而提取胆甾醇氧化酶,用胆酸盐处理细胞,提取一种膜结合的葡聚糖酶等。处理完后,可采用凝胶层析等方法,将表面活性剂除去,以免影响酶的进一步分离纯化。 表面活性剂处理法对膜结合酶的提取特别有效,在实验室和生产中均已成功使用。 第一节 细胞破碎 五、生物破碎法 在一定条件下,通过外加的酶或细胞本身存在的酶的作用,使细胞破碎。 1.外加酶处理 根据细胞外层结构的特点,选用适当的酶,使细胞壁破坏,并在低渗透压的溶液中使细胞破裂。 革兰氏阳性菌主要依赖其细胞壁中的肽多糖维持其细胞结和形状。溶菌酶能专一地作用于肽多糖的β-1,4-糖苷键。所溶菌酶常用于革兰氏阳性菌的细胞破碎。对于革兰氏阴性菌,则在加入溶菌酶的同时,还要加入EDTA,才能达到细胞破碎的效果。酵母细胞壁的主要成分是β-l,3-葡聚糖,酵母细胞的破碎需外加一定量的β-葡聚糖酶。而霉菌细胞壁含有几丁质,故此,几丁质酶可用于霉菌的细胞破碎。纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶往往混合使用,作用于植物细胞的细胞壁,而使植物细胞破碎。 由于溶菌酶等上述列举的酶价格较高,而且外加酶本身混入细胞破碎液中成为杂质,故此,外加溶菌酶的方法难以用于大规模工业生产。 第一节 细胞破碎 2.自溶法 将细胞在一定的pH值和适宜的温度条件下保温一段时间,通过细胞本身存在的酶系将细胞破坏,使胞内物质释出的方法称为自溶法。

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