依博素生物合成基因ste15的克隆表达与酶学性质研究.pdfVIP

依博素生物合成基因ste15的克隆表达及酶学性质研究 李晓华 李 元 ( 中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所 北京 100050) 摘 要： 目的 测定依博素生物合成基因ste15 的酶学性质。方法 将ste15 基因克隆至质粒 pET30a ，在大肠杆菌BL21(DE3) 中进行表达，用连续偶联分光光度法对纯化的Ste15蛋白进 行酶活性测定。结果 SDS结果显示在大约50kD处出现了一条新的蛋白条带，与推测 值相符。Ste15蛋白在E.coli 中以可溶和包涵体两种形式表达，二者各占50 ％，取可溶形式 的蛋白用镍亲和柱层析纯化，得到单一条带蛋白。Ste15蛋白只催化UDP-葡萄糖转移到糖 基接受体上，生成UDP ，偶联NADH 的氧化反应，而对其他几种活化糖基供体没有催化活 性。结论 Stel5蛋白是葡萄糖糖基转移酶，负责依博素生物合成中将核苷酸葡萄糖到多糖重 复单元增长链的转移。 关键词：链霉菌，基因表达，依博素生物合成 葡萄糖糖基转移酶 依博素是一种由链霉菌139 (Streptomyces. sp.139)产生的可能用于治疗类风湿性关节炎 的I类新药，正在申报临床[1]。依博素由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木 糖、岩藻糖和半乳糖糖醛酸共8种单糖组成[2]。依博素生物合成基因簇ste 已被确定，其中ste15 基因的大小为1,269bp，编码一个422-aa 的蛋白[3] 。同源性比较表明其编码产物的C 端 （217-369aa ）含有类似pfam00534 的结构域，属于糖基转移酶家族1，该家族的糖基转移酶 催化UDP、ADP、GDP 或 CMP 连接的活化糖基转移至作用底物，包括糖原，6-磷酸果糖， - 脂多糖。本室通过基因同源重组双交换获得基因缺失变株Streptomyces sp 139(ste 15 ) ［4 ］， 与依博素相比，该变株产生的多糖衍生物EPS-15m ，葡萄糖组分消失 （3.9％? 0 ％），遗传 互补株ste15c产生的多糖衍生物EPS-15c ，葡萄糖组分得到一定恢复 （0 ％? 1.08％）[4] ， 由此推测ste15基因可能编码葡萄糖糖基转移酶，参与依博素的生物合成。本文对ste15基因 进行了克隆和表达，用连续偶联分光光度计测量分析法测定了该蛋白的酶学活性，确定其 为葡萄糖糖基转移酶，负责依博素生物合成中将核苷酸葡萄糖到多糖重复单元增长链的转 移。 1 材料和方法 1.1 ste15基因的克隆和表达 以S.sp.139总DNA为模板，以5-GTTCCATGGTCATGCACGTCATGGTGG-3 (NcoI)和5- GGCAAGCTTTCATCTGTTTCCCCCATCC-3 (HindIII)为引物，进行PCR反应，反应条件为： 95℃ 3min ；94℃ 45s ，50℃ 50s ，72℃1min，共30个循环；72℃ 10min 。扩增的片段与pET30a 质粒相连，转化至E.coli BL21(DE3)受体菌，获得转化子。转化子提取质粒后进行酶切鉴定， 含预期片段的重组质粒命名为pET30a-Ste15 ，重组菌株命名为BL21/pET30a- ste15，并进行 序列测定。将BL21/pET30a- ste15 按1％接种于含有25µg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃培 养至DD600 约0.4时，加入IPTG(终浓度为0.5mmol/L) ，诱导4h后，收集菌体。 1.2 重组Ste15蛋白的纯化 将诱导表达后的菌体以 5ml/g 悬浮于预冷的 1×Binding Buffer (50mmol/L NaH PO ,300mmol/L NaC1，10mmol/L imidazole ，pH 8.0) 中，置冰浴进行超声破碎，10,000rpm 2 4 离心收集上清液，45µm 滤膜过滤后与Ni2+-NTA His ·Bind Resins 4 ℃结合过夜。将蛋白上清 液上镍亲和