金黄色葡萄球菌核酸探针检测方法的建立.pdfVIP

金黄色葡萄球菌核酸探针检测方法的建立 薛力刚1 刘金华2 王全凯1 王振国2 1．吉林农业大学动物科学技术学院，长春，130118 2．吉林出入境检验检疫局，长春，130062 摘要 目的建立快速检测食品中金黄色葡萄球菌的核酸探针检测法。方法通过使用吖 啶酯标记的特异DNA探针方法检测金黄色葡萄球菌，并对其特异性及敏感性进行研究，比较 该方法与传统国标法的检测效果。结果核酸探针检测方法特异性及敏感性强，检出纯培养菌 落最低限为106cfu／ml，检测结果与国标法一致。结论核酸探针方法可用于食品中金黄色葡 萄球菌的快速检测。 关键词 金黄色葡萄球菌；核酸探针；检测 金黄色葡萄球菌(以下简称金葡菌)是一种可引 氯化钠肉汤、冻干血浆和胰蛋白胨大豆肉汤均购自 起人类和动物化脓感染的重要致病菌，也是常见的 北京陆桥公司；裂解液购自法国梅里埃公司；十二烷 食源性致病菌。该菌广泛分布在空气、水、灰尘及人 基硫酸锂购自白灵威化学技术有限公司；氯化锂和 和动物的排泄物中，食品较易受其污染。近年，美国 EGTA均购白上海生工生物丁程技术服务有限公 疾病控制中心报告，由金葡菌引起的感染占第二位， 司；GEN—PROBELEDER50i发光仪和GEN— 仅次于大肠杆菌[1]。由金葡菌引起的食物中毒极为 PROBE加热器(60oC±1℃)均为法国梅里埃公司 普遍，每年都有金葡菌引起的食物中毒病例，造成巨 产品。 大经济损失[2]。目前世界各国均将金葡菌列为食品 3．培养基的配制 卫生的法定检测项目。 探针稀释液：0．01mol／I。琥珀酸缓冲液(pH5)； 我国目前对食品中金葡菌检测采用的方法是以 国家标准GB／T4789．10—2003及行业标准SN0172— 1992作为依据，通过对样品增菌处理后，进行平板 0．6mol／L 划线，然后挑取可疑菌落进行形态、染色及血浆凝固 Na28407缓冲液(pH8．5)；试剂工：含 酶试验后，进行判定[引。检测过程需5～6d，难以适 0．1％H202的lmmol／LHN03；试剂11：lmol／L 应快速检验的要求。因此，建立一种灵敏、特异、简 NaOH。 便快速的鉴定方法尤为重要。本文应用液相核酸探 4．金葡茵的分离及鉴定 针方法快速检测食品中的金葡菌。 按GB／T 至225ml灭菌生理盐水巾，均质后，吸取5mI接种 材料与方法 于50ml10％氯化钠肉汤中，36℃±1℃培养24h， 1．菌株 金黄色葡萄球菌(ATCCl2600)、表皮葡萄球菌可疑的金葡菌菌落进行革兰染色镜检及血浆凝固酶 (ATCCl3518)、大肠杆菌(ATCCl3762)、鸡葡萄球试验L引。 菌(ATCC700401)、肠炎沙门菌(ATCCl3076)、绿5．核酸探针的设计及合成 脓杆菌(ATCC9027)、蜡样芽孢杆菌根据GenBank公布的金葡菌部分16SrRNA (ATCCll778)、单增李斯特菌(ATCC7644)、空肠(NM：D83353)序列设计探针：5 弯曲菌(ATCC33291)前4种购自上海汉尼公司，后 5种购自中国药品生物制品检定所，使用时先无菌 作手臂。经活化后接上吖啶酯，制成发光探针，由宝 接种在营养肉汤中复苏传代。 生物下程(大连)有限公司合成。 2。试剂及仪器 6．核酸杂交保护分析方法 Baird—Parker琼脂、亚硫酸盐卵黄增菌液、10％取金葡菌纯培养菌落于12×75mm的聚苯乙 ·368·