JC病毒T抗原诱导自发肿瘤转基因动物模型建立及发癌机理及研究.pdf

·中文论著摘要· JC病毒T抗原诱导自发肿瘤转基因动物 模型建立及发癌机理研究 刖 吾 JC病毒(John virus，JCV)是多瘤病毒家族成员之一，还包括 Cunningham SV40和BK病毒。血清学调查显示，普通成人JCV感染率高达80．90％。当机体 免疫力低下时，JCV大量繁殖可损伤神经系统，导致进行性多灶性白质脑病 T (PML)，若整合到人类基因组可导致肿瘤发生。静脉和颅内注入JCV或将JCV 抗原转入基因组后均可诱发多种神经系统肿瘤，也有实验结果表明JCVT抗原的 存在与结肠癌、食道癌、肺癌、口腔舌、咽鳞癌和前列腺癌发生关系密切。研究 体肿瘤在1年后发生淋巴结和肺转移。本研究利用晶状体a-crystallin和胃粘膜 K19特异启动子构建JCVT抗原高表达转基因鼠，建立JCVT抗原诱导自发肿瘤 动物模型。分析JCVT抗原诱导自发肿瘤的分子病理学特点及JCVT抗原RNA 选择性剪接在肿瘤形成中的作用。 材料与方法 T抗原、K19．JCV T抗原表 l、构建a．crystallin-JCV T抗原和pEGFP—N1一JCV 达质粒。 T抗原和K19．JCVT抗原转基因鼠，各 2、显微注射，制备a．crystallin．JCV 个品系PCR鉴定阳性鼠仔与野生鼠交配繁育，几代后反交配制备并筛选纯合鼠， 比较a-erystallin．JCVT抗原纯合鼠与杂合鼠的发瘤时间。 T抗原纯合鼠尾DNA，普通PCR和点杂交检测JCV 3、提取a．crystallin．JCV T抗原的存在，实时PCR检测各个品系JCVT抗原的拷贝数。 T抗原转基因鼠明显肿瘤样改变的眼球和脑组织， 4、摘取a-crystallin．JCV 原的免疫荧光染色。 T抗原转基因鼠，使其俯卧位进 5、对于严重肿瘤样改变的a．crystallin．JCV 行核磁共振检测，尸检后HE染色或T抗原免疫组化确定晶状体肿瘤细胞是否发 生脑侵袭。 6、提取K19．JCVT抗原转基因鼠的胃和肺组织，固定制作成石蜡标本，进 行HE、免疫组化和原位杂交检测确定T抗原的存在及定位。 T抗原转基因鼠Diane瘤组织和K19．JCVT抗原转基 7、提取if,．crystallin．JCV 因鼠胃组织总RNA，逆转录合成eDNA，并设计跨内含子引物，同时PCR扩增 两种转基因鼠的cDNA，检测JCVT抗原的选择性剪接是否存在组织特异性。 8、培养消化道癌细胞、神经系统肿瘤细胞、肺癌细胞、子宫内膜癌细胞、 人胚肾细胞、人胚肾上皮细胞、鼠成纤维细胞和人晶状体上皮细胞，并用 T抗原质粒进行转染，荧光显微镜观察T抗原表达情况，RT-PCR pEGFP-N1．JCV 确定JCVT抗原RNA选择性剪接是否存在细胞特异性。 牯 里 二日7I号 原表达质粒，经酶切鉴定测序，Blast比对序列及方向均正确。 T抗原转基因原代鼠和4个品系的 2、获得5个品系的a．crystallin．JCV K19．JCV T抗 T抗原转基因原代鼠，经繁育后已筛选出纯合鼠。a-crystallin．JCV 原转基因纯合鼠的发瘤时间早于杂合鼠。 T抗原的五个品系中2 鼠均有T抗原的存在，实