肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物耐药机制与研究.pdf

目 录 中文摘要 4 英文摘要 7 前 言 11 第一部分 对碳青霉烯类药物耐药肠杆菌科细菌的体外药敏试验.. 13 1.1 材料和方法 13 1.1.1 实验材料与仪器 13 1.1.2. 试验方法 14 1.2 结果 16 1.3 讨论 19 第二部分 对碳青霉烯类药物耐药肠杆菌科细菌表型及耐药基因检测21 2.1 材料和方法 21 2.1.1 实验材料与仪器 21 2.1.2 试验方法 22 2.2 结果 25 2.2.1 改良Hodge 试验筛查碳青霉烯酶 25 2.2.2 EDTA 双纸片协同法筛查金属酶 26 2.2.3 PCR 技术检测耐药基因 27 2.3 讨论 32 第三部分 Real-time PCR 技术分析膜孔蛋白基因 35 3.1 材料和方法 35 3.1.1 实验材料与仪器 35 2 3.1.2 试验方法 36 3.2 结果 39 3.2.1 细菌RNA 提取结果 39 3.2.2 膜孔蛋白Real-time PCR 结果 39 3.3 讨论 41 第四部分 耐药基因水平传播能力的研究 43 4.1 材料和方法 43 4.1.1 实验材料与仪器 43 4.1.2 试验方法 45 4.2 结果 48 4.2.1 利用PCR 技术扩增整合子并分析其基因序列 48 4.2.2 质粒结合结果 50 4.2.3 结合子体外药敏试验 50 4.2.4 EDTA 协同试验筛查结合子金属β-内酰胺酶 52 4.2.5 质粒提取 53 4.2.6 结合子质粒酶切结果 54 4.3 讨论 55 结 论 58 参考文献 60 致 谢 66 英汉缩略词对照表 67 肠杆菌科细菌产金属β-内酰胺酶的研究进展（综述） 69 3 肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物耐药机制的研究 摘 要 目的 本研究拟通过对四川省某三甲医院临床分离的 60 株多重耐药的 肠杆菌科细菌耐药谱进行分析，筛选出对碳青霉烯类抗生素耐药的肠 杆菌科细菌10 株进行碳青霉烯酶表型、耐药基因、外膜蛋白的检测以 及检测整合子和质粒结合试验的研究，旨在阐明肠杆菌科细菌对碳青 霉烯类抗生素耐药的主要机制以及细菌耐药性的水平传播能力，对指 导临床合理使用抗生素，减少耐药菌株的产生、控制和预防耐药菌株 的流行提供科学依据。 方法 1. 收集四川省某三甲医院2010 年1 月-2011 年5 月临床分离的多 重耐药的肠杆菌科细菌。2. 用琼脂稀释法检测多重耐药的肠杆菌科细 菌对 13 种抗生素的最低抑菌浓度（MIC ），分析其耐药谱，筛选出对 碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌。3. 改良Hodge 试验筛查对碳 青霉烯类抗生素耐药菌株产碳青霉烯酶的情况。4. EDTA 双纸片协同 试验筛查对碳青霉烯类抗生素耐药菌株产金属β- 内酰胺酶情况。5. 利 用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR ）技术检测耐碳青霉 烯类抗生素菌株耐药基因，其测序结果与GenBank 数据库进行比对。 6. 膜孔蛋白逆转录Real-time PCR 分析耐药株膜孔蛋白的表达情况。 7. 利用 PCR 技术扩增耐碳青霉烯类抗生素菌株整合子并分析其基因 序列。8. 利用质粒结合试验研究耐碳青霉烯类抗生素菌株耐药性的水 平传播能力。 结果 1. 收集 60 株四川某三甲医院临床分离的多重耐药的肠杆菌科细 菌。2. 本研究利用琼脂稀释法药敏试验对 60 株临床分离的多重耐药 的肠杆菌科细